求RT-PCR 流程和注意事項

博凌科為-為你解答：RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求： 1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不會出太大問題。3. PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。 1）RT和PCR時的引物設(shè)計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須在RT時，引物設(shè)計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產(chǎn)

pcr試驗是什么意思？

PCR目錄 〔PCR原理〕 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 〔PCR步驟〕 〔PCR檢測〕 〔PCR反應(yīng)特點〕 [PCR儀器] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。 DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年發(fā)現(xiàn) ，而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。現(xiàn)今所使用的酶(簡稱 Ta

如何測定一段已知序列DNA的旁側(cè)序列

這樣吧:克隆就可以了 一種簡單有效的克隆未知旁側(cè)DNA片段的方法 中華基因網(wǎng) 宋保亮 戚煒 李伯良 宋保亮（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所分子生物學(xué)國家重點實驗室,上海,200031） 戚煒（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所分子生物學(xué)國家重點實驗室,上海,200031;南京大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系,南京,210093） 李伯良（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所分子生物學(xué)國家重點實驗室,上海,200031） 摘 要：操作含長插入片段的DNA克隆時, 經(jīng)常需要進行亞克隆和測序?qū)嶒? 通常的方法首先是得到插入片段的限制性內(nèi)切酶譜, 然后

DNA親子鑒定的具體流程？

隱私鑒定不需要被鑒定者提供身份證件，不方便到場的情況下還可采取郵寄樣品的方式。隱私鑒定只需要鑒定樣本即可，不需要提供證件和照片。個人親子鑒定的目的在于消除猜忌和疑慮，維護家庭的和睦穩(wěn)定。 司法親子鑒定的流程 01 當(dāng)事人必須提供有效證件的正本，由鑒定單位的工作人員核對和驗證身份無誤后，復(fù)印存檔，正本當(dāng)即歸還當(dāng)事人。 02 當(dāng)事人親筆填寫“親子鑒定申請書”，包括當(dāng)事人的基本情況、申請原因等。孩子年幼無書寫能力的，可由父母代為填寫，再由小孩按手印確認(rèn)。 03 親子鑒定單位給當(dāng)事人拍照存檔，合影照片將用于親子鑒定報告。 04 采集每位當(dāng)事人的血樣，每人采血2-3毫升;采血完畢，要求被采血當(dāng)事人簽名，

生物進化過程中，基因起到了什么樣的作用？

有時，在生命的歷史中，一種新的性狀會進化，從而導(dǎo)致一組生物體內(nèi)的多樣性激增。以翅膀為例，它們的每一類動物都進化出許多不同的物種，如鳥、蝙蝠、昆蟲和翼龍。科學(xué)家稱這些為“關(guān)鍵創(chuàng)新”。

了解“關(guān)鍵創(chuàng)新”的發(fā)展對于理解地球上有機體的進化至關(guān)重要。其中大多數(shù)發(fā)生在遙遠的過去，使它們很難從遺傳學(xué)角度進行研究。幸運的是，在過去的幾百萬年中，有一組植物獲得了這種特性。

帶有花蜜刺的耬斗菜，為科學(xué)家們提供了一個機會，來研究支持一項關(guān)鍵創(chuàng)新的遺傳變化。經(jīng)過大量研究，加州大學(xué)圣塔芭芭拉分校的教授斯科特·霍奇斯（ScottHodges），研究助理伊萬杰琳·巴列里尼（EvangelineBallerini）和他們在哈佛大學(xué)的合著者，已經(jīng)確定了對這些結(jié)構(gòu)的發(fā)育至關(guān)重要的基因。并且據(jù)他們所知，這是已經(jīng)鑒定出關(guān)鍵發(fā)育基因的首批“關(guān)鍵創(chuàng)新”之一。他們的發(fā)現(xiàn)發(fā)表在PNAS雜志上。

研究人員以圣安東尼奧馬刺籃球隊主教練格雷格·波波維奇（GreggPopovich）命名該基因。“該基因是一個轉(zhuǎn)錄因子，這意味著它可以通過調(diào)節(jié)其他基因的活性來控制耬斗菜的花刺發(fā)育?！卑土欣锬峤忉屨f，“所以我之所以選擇波波維奇這個名字，是因為作為教練，波波維奇在某種意義上通過調(diào)節(jié)球員的活動，來控制圣安東尼奧馬刺隊的發(fā)展。”

耬斗菜祖先的花刺進化似乎導(dǎo)致了該屬的迅速擴展。在過去的5到7百萬年中，大約有70個物種進化，而其無毛的姊妹屬只有4種。

耬斗菜不是唯一帶有花刺的花。該性狀在包括金蓮花、百靈鳥和鳳仙花在內(nèi)的許多不同植物中獨立地進化?；羝嫠拐f：“在每個族群中，有花刺的花比沒有花刺的近親擁有更多的物種?！?/p>

巴列里尼說：“我們認(rèn)為多樣性與花刺的進化有關(guān)，因為花刺產(chǎn)生的花蜜吸引著動物的授粉媒介?！备淖兓ù痰拈L度或形狀會改變能給花授粉的動物。“蜜蜂只是在蜂花之間移動花粉，蜂鳥只是在蜂鳥花朵之間移動花粉，因此您不會在這兩個不同種群之間交換基因?！弊罱K，兩者可以分裂成不同的物種。

研究人員試圖回答的問題是，這類創(chuàng)新首先是如何發(fā)展的。霍奇斯說：“如果我們能找到對關(guān)鍵創(chuàng)新發(fā)展至關(guān)重要的基因，那將有助于我們理解這種過程?！?/p>

“在大多數(shù)情況下，例如在鳥類、蝙蝠和昆蟲的翅膀例子中，它們進化得很早，以至于很難找到對進化該特性至關(guān)重要的特定基因?！彼a充說，“在這里，我們只有5到7百萬年前才有一項關(guān)鍵創(chuàng)新的起源，這是一個相當(dāng)簡單的特征，所以它要簡單一些?！?/p>

尋找波波維奇（POPOVICH）

由于耬斗菜是最近進化的，因此它們中的大多數(shù)可以彼此形成可育的雜種。在1950年代和60年代，波蘭的遺傳學(xué)家將其表兄弟姐妹與一個無毛的物種（適當(dāng)?shù)胤Q為無毛的哥倫拜因）雜交。她發(fā)現(xiàn)在第一代后代中都有花刺，但是自花授粉產(chǎn)生了第二代，在四分之一的植物中再次出現(xiàn)了無刺毛。

大約半個世紀(jì)后，這一比例對霍奇斯和巴列里尼的工作至關(guān)重要。這個簡單的分?jǐn)?shù)表明單個基因控制著花刺的發(fā)展。但是耬斗菜大約有30,000個基因，只有一個是他們想要的基因。

跟隨他的前任的腳步，霍奇斯還用一種被刺激的物種越過了無刺的耬斗菜，然后對其后代進行了自花授粉。但是與以前的實驗不同的是，巴列里尼和霍奇斯現(xiàn)在有了搜索植物遺傳密碼的工具。

巴列里尼對近300株第二代植物中的每一種進行了基因組測序，并尋找無毛植物從其無毛祖父母那里繼承了兩個拷貝的實例。這將搜索范圍縮小到了一種植物染色體上的約1,100個基因。

仍然有1,100個基因需要分類?！盁o法保證這些方法會導(dǎo)致我們找到我們想要的基因。”巴列里尼說，“在所有的實驗和分析中肯定有很多工作要做，但最后還是有些運氣?！?/p>

巴列里尼檢查了無刺耬斗菜和其他三個受刺激物種中花瓣早期發(fā)育五個階段的基因表達。她對每個階段打開的所有基因進行了測序，尋找無毛植物和帶毛植物之間的一致差異。最終，在哈佛大學(xué)一位合作者的幫助下，巴列里尼懷疑她已經(jīng)確定了正確的基因。它總是在無毛種中關(guān)閉，在有毛種中打開，并且是先前在遺傳雜交中鑒定為與無毛花相關(guān)的1100個基因之一?，F(xiàn)在該發(fā)現(xiàn)驗證了她的假設(shè)。

她使用轉(zhuǎn)基因病毒敲低了該基因以及產(chǎn)生紅色色素的關(guān)鍵基因的表達。這樣一來，他們只要看一下顏色就能分辨出哪些花瓣受到了影響。

在波波維奇（POPOVICH）邊上的任何地方，花都會長出細小的花刺。但是，其長度取決于單元的數(shù)量和大小。因此，研究人員與合作者一起計算了組成這些細小花刺的每個細胞的數(shù)量并測量了它們的長度。

“較長的花刺具有更多的細胞，較短的馬刺具有更少的細胞?！被羝嫠怪赋?，“因此，該基因一定是通過影響產(chǎn)生多少細胞而起作用的?！?/p>

巴列里尼記得完成最后的分析后坐在辦公室里。她開始向潛在的體育愛好者研究生扎克·卡賓（ZacCabin）拋出潛在的基因名稱。她回憶說：“與此同時，扎克和我互相轉(zhuǎn)身，都說'波波維奇（POPOVICH）！'。”這個名字似乎很合適。“而且，如果我們確定其他基因在花刺發(fā)展中發(fā)揮作用，那么我們就有可能以馬刺隊中的一些參與者的名字命名它們?！?/p>

通往新發(fā)現(xiàn)的道路

雖然確定波波維奇（POPOVICH）當(dāng)然是一項成就，但這項發(fā)現(xiàn)的真正價值在于它揭示了“關(guān)鍵創(chuàng)新”的演變。在這項工作之前，沒有一個植物群，具有有眾所周知的花刺基因組。"我們不知道從哪里開始，"霍奇斯說。"這一發(fā)現(xiàn)為我們提供了立足之地。

他補充說：“一旦我們確定了一個基因，就像這個基因，這似乎是花刺形成過程中的關(guān)鍵，那么我們就可以開始找出所有的成分了?！痹撔〗M現(xiàn)在可以開始研究波波維奇（POPOVICH）調(diào)控哪些基因，以及哪些基因調(diào)控波波維奇（POPOVICH）?！斑@是全面了解整個系統(tǒng)立足點?！?/p>

盡管研究人員不知道波波維奇（POPOVICH）在其他植物群中如何發(fā)揮作用，但它似乎會影響在三葉草上生長的小葉數(shù)量。耬斗菜在其葉片中也表達該基因。巴列里尼建議，也許它是從葉子中吸收到花瓣發(fā)育的。

她解釋說，新穎的改編并非無所不在?！爱?dāng)您在開發(fā)一個新結(jié)構(gòu)時，通常不會在開發(fā)一個全新的基因?！蓖ǔ＃飳ΜF(xiàn)有基因進行重新啟用或增加用途。

作者還有興趣識別涉及刺激形成第二階段的基因：刺激花刺中細胞的伸長率。

“現(xiàn)在，我們已經(jīng)確定了這個基因，就要做這些事情。”霍奇斯說，“而且由于它是一個轉(zhuǎn)錄因子，它必須具有受到影響的特定基因。下一步的邏輯步驟是確定該基因的靶標(biāo)，這將使我們更加了解其功能?！?/p>