PE在流式中是什么

藻紅蛋白(P-phycoerythrin,PE)是從紅藻中分離純化的，普遍使用地新型熒光標(biāo)記試劑。

在特定波長(zhǎng)激發(fā)下，藻膽蛋白能發(fā)射強(qiáng)烈的熒光，其熒光強(qiáng)度是熒光素的30-100倍。具有很好的吸光性能和很高的量子產(chǎn)率，在可見(jiàn)光譜區(qū)有很寬的激發(fā)及發(fā)射范圍。

與所有藻膽蛋白一樣，它由稱為藻膽素的蛋白質(zhì)部分共價(jià)結(jié)合發(fā)色團(tuán)組成。在藻紅蛋白家族中，最著名的藻膽蛋白是：藻紅蛋白，典型的藻紅蛋白受體發(fā)色團(tuán)。藻紅蛋白是一種線性四吡咯分子，存在于藍(lán)藻、紅藻和隱單胞菌中。

與其他膽素（如藻藍(lán)膽素）一起，它在稱為藻膽體的藍(lán)藻光合光捕獲結(jié)構(gòu)中充當(dāng)光捕獲色素。藻紅蛋白由 (αβ) 單體組成，通常組織成圓盤狀三聚體(αβ)3或六聚體(αβ)6（第二個(gè)是天線桿的功能單元）。這些典型的復(fù)合物還包含第三種類型的亞基，γ 鏈。

實(shí)際應(yīng)用

R-藻紅蛋白（也稱為 PE 或 R-PE）在實(shí)驗(yàn)室中可用作基于熒光的指示劑，用于指示藍(lán)藻的存在和標(biāo)記抗體，最常用于流式細(xì)胞術(shù)。

它還用于微陣列分析、ELISA 和其他需要高靈敏度但不具有光穩(wěn)定性的應(yīng)用。由于其快速光漂白，其在免疫熒光顯微鏡中的使用受到限制特征。還有其他類型的藻紅蛋白，例如 B-藻紅蛋白，它們的光譜特性略有不同。

B-藻紅蛋白在約 545 nm（略帶黃綠色）處強(qiáng)烈吸收，而在 572 nm（黃色）處強(qiáng)烈發(fā)射，可能更適合某些儀器。B-藻紅蛋白的“粘性”也可能低于 R-藻紅蛋白，并且由于某些應(yīng)用中的非特異性結(jié)合而對(duì)背景信號(hào)的貢獻(xiàn)較小。

ELISA間接法中一抗二抗的稀釋用PBST或PBSM（包被液）有沒(méi)有什么差異？

一般直接用PBS或者PBST就可以了，PBSM應(yīng)該是封閉液吧，理論上也可以。但有沒(méi)有差別，不好說(shuō)，只有自己試過(guò)才知道，因?yàn)榕Ｄ坛煞輳?fù)雜，一般的指標(biāo)是沒(méi)有影響的，但不能保證所有指標(biāo)都適用。 商品化的ELISA抗體稀釋液應(yīng)該還含有一些穩(wěn)定劑。但如果不存放，現(xiàn)配現(xiàn)用，與PBS或者PBST應(yīng)該是沒(méi)有差別的。

流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍

隨著對(duì)FCM研究的日益深入，其價(jià)值已經(jīng)從科學(xué)研究走入了臨床應(yīng)用 階段，在我國(guó)臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里已有著廣泛的應(yīng)用?？捎糜诎籽〉姆中?、腫瘤細(xì)胞染色體的異倍性測(cè)定，以及免疫學(xué)研究，并已開(kāi)始用于細(xì)菌鑒定，病毒感染細(xì)胞的識(shí)別和艾滋病感染者T4、T8細(xì)胞的記數(shù)。
自70年代以來(lái)，隨著流式細(xì)胞技術(shù)水平的不斷提高，其應(yīng)用范圍也日益廣泛。流式細(xì)胞術(shù)已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用
這是FCM在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最早的一個(gè)領(lǐng)域。首先需要把實(shí)體瘤組織解聚、分散制備成單細(xì)胞懸液，用熒光染料(碘化吡啶PI)染色后對(duì)細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行分析，將不易區(qū)分的群體細(xì)胞分成三個(gè)亞群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表細(xì)胞的倍體狀態(tài)，非倍體細(xì)胞與腫瘤惡性程度有關(guān)。
(1)發(fā)現(xiàn)癌前病變，協(xié)助腫瘤早期診斷：人體正常組織發(fā)生癌變要經(jīng)過(guò)一個(gè)由量變到質(zhì)變的漫長(zhǎng)過(guò)程，而癌前細(xì)胞即處于量變過(guò)程中向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化階段。人體正常的體細(xì)胞均具有比較穩(wěn)定的DNA二倍體含量。當(dāng)人體發(fā)生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時(shí)，在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可伴隨細(xì)胞DNA含量的異常改變，F(xiàn)CM可精確定量DNA含量的改變，作為診斷癌前病變發(fā)展至癌變中的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)志，能對(duì)癌前病變的性質(zhì)及發(fā)展趨勢(shì)作出估價(jià)，有助于癌變的早期診斷。有資料證實(shí)，癌前病變的癌變發(fā)生率與細(xì)胞不典型增生程度有密切關(guān)系，增生程度越重，癌變發(fā)生率越高。隨著細(xì)胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍體出現(xiàn)率增高，這是癌變的一個(gè)重要標(biāo)志。
(2)在腫瘤的診斷、預(yù)后判斷和治療中的作用：FCM在腫瘤診斷中的重要作用已經(jīng)被認(rèn)可，DNA非整倍體細(xì)胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據(jù)，F(xiàn)CM分析病理細(xì)胞具有速度快、信息量大，敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，已被用在常規(guī)工作中。腫瘤細(xì)胞DNA倍體分析對(duì)病人預(yù)后的判斷有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高、死亡率也高，而二倍體及近二倍體腫瘤的預(yù)后則較好。
FCM不僅可對(duì)惡性腫瘤DNA含量進(jìn)行分析，還可根據(jù)化療過(guò)程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評(píng)估療效，了解細(xì)胞動(dòng)力學(xué)變化，對(duì)腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫(yī)師可以根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，依據(jù)化療藥物對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的干擾理論，設(shè)計(jì)最佳的治療方案，從DNA直方圖直接地看到瘤細(xì)胞的殺傷變化，及時(shí)選用有效的藥物，對(duì)瘤細(xì)胞達(dá)到最大的殺傷效果。
此外FCM近幾年還被應(yīng)用于細(xì)胞凋亡和多藥耐藥基因的研究中[3，4]。醫(yī)學(xué)工作者開(kāi)始研究如何用藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。通過(guò)對(duì)細(xì)胞體積、光散射、DNA含量及特異性抗原基因(如bcl-2, Fas等)測(cè)定分析出細(xì)胞凋亡情況。多藥耐藥是腫瘤病人化療失敗的主要原因，F(xiàn)CM對(duì)多藥耐藥基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達(dá)的測(cè)定，可為臨床治療效果分析提供有力依據(jù)。
在臨床中的作用
FCM通過(guò)熒光抗原抗體檢測(cè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞表面抗原分析，進(jìn)行細(xì)胞分類和亞群分析。這一技術(shù)對(duì)于人體細(xì)胞免疫功能的評(píng)估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治療有重要作用。有大量文章介紹了淋巴細(xì)胞亞群等在各種疾病中的變化。正常人群淋巴細(xì)胞T4/T8比值大約為2∶1，但在人體細(xì)胞免疫力低下時(shí)可出現(xiàn)比例倒置。用FCM還可以監(jiān)測(cè)腎移植后病人的腎排斥反應(yīng)，如果T4/T8比例倒置，病人預(yù)后良好，較少發(fā)生腎排異現(xiàn)象；反之排異危險(xiǎn)性增加。同樣此種測(cè)定技術(shù)也用于艾滋病的診斷和治療中。還有作者報(bào)告了外周血淋巴細(xì)胞免疫表型的參考值，并對(duì)其種族、性別、年齡等影響因素進(jìn)行了探討[5]。
目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經(jīng)發(fā)展到了百余種，可以對(duì)各種血細(xì)胞和組織細(xì)胞的表型進(jìn)行測(cè)定分析。
在血液病診斷和治療中的應(yīng)用
FCM通過(guò)對(duì)外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA的檢測(cè)分析，對(duì)各種血液病的診斷、預(yù)后判斷和治療起著舉足輕重的作用。
(1)白血病的診斷和治療：FCM采用各種抗血細(xì)胞表面分化抗原(CD)的單克隆抗體，借助于各種熒光染料(異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞的多種參數(shù)，以正確地判斷出該細(xì)胞的屬性。各種血細(xì)胞系統(tǒng)都具有其獨(dú)特的抗原，當(dāng)形態(tài)學(xué)檢查難以區(qū)別時(shí)，免疫表型參數(shù)對(duì)各種急性白血病的診斷和鑒別診斷有決定性作用[6]。例如干細(xì)胞表達(dá)CD34，髓系表達(dá)CD13、CD14，B細(xì)胞系表達(dá)CD10、CD19、CD20等，T細(xì)胞系表達(dá)CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以測(cè)定出血細(xì)胞表達(dá)各種抗原的水平，協(xié)助臨床確診。
同其它腫瘤的治療一樣，測(cè)定DNA倍體和進(jìn)行細(xì)胞周期分析對(duì)指導(dǎo)白血病化療有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細(xì)胞增殖狀況不同，定期了解細(xì)胞增殖情況采取相應(yīng)藥物可以提高療效。
目前臨床除化療藥物治療外還采用造血干細(xì)胞移植技術(shù)治療急性白血病和一些疑難性疾病[7]。FCM通過(guò)對(duì)人白細(xì)胞抗原(HLA)配型的測(cè)定可以為異體干細(xì)胞移植病人選擇出最合適的供體。造血干細(xì)胞移植技術(shù)主要包括干細(xì)胞的鑒別、活性測(cè)定、干細(xì)胞動(dòng)員和采集、分離純化、保存擴(kuò)增、腫瘤細(xì)胞的凈化、干細(xì)胞回輸以及術(shù)后保持移植物抗宿主病的低發(fā)生率等一系列過(guò)程。FCM測(cè)定CD34、HLA-DR、CD33等細(xì)胞表面標(biāo)志物，成為干細(xì)胞移植技術(shù)重要的監(jiān)測(cè)手段。用FCM檢測(cè)一系列指標(biāo)觀察病人的恢復(fù)狀態(tài)，可以對(duì)預(yù)后做出早期的判斷。
(2)其它種類血液病的診斷和治療監(jiān)測(cè)：陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種造血干細(xì)胞克隆病，細(xì)胞CD55、CD59抗原表達(dá)減低是該病的一個(gè)特點(diǎn)。該抗原屬于血細(xì)胞表面磷脂酰肌醇錨連蛋白家族，是重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，它通過(guò)與補(bǔ)體C8、C9的結(jié)合以阻止補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物的形成，從而抑制細(xì)胞被補(bǔ)體激活溶解。FCM采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)血細(xì)胞CD59的表達(dá)做定量分析，可以協(xié)助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴(yán)重程度[8]。
(3)網(wǎng)織紅細(xì)胞的測(cè)定及臨床應(yīng)用：網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映骨髓造血功能的重要指標(biāo)，F(xiàn)CM通過(guò)某些熒光染料(吖啶橙、噻唑橙等)與紅細(xì)胞中RNA結(jié)合，定量測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞中RNA，得到網(wǎng)織紅細(xì)胞占成熟紅細(xì)胞的百分比。有作者報(bào)道FCM方法比目測(cè)法結(jié)果精確度更高[9]。此外FCM還可以測(cè)量出網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟度，對(duì)紅細(xì)胞增殖能力的判斷很有意義[10]。為干細(xì)胞移植術(shù)后恢復(fù)的判斷、貧血的治療監(jiān)測(cè)、腫瘤病人放化療對(duì)骨髓的抑制狀況等提供了依據(jù)。
在血栓與出血性疾病中的應(yīng)用
(1)血小板功能的測(cè)定：正常情況下血小板以分散狀態(tài)在血管內(nèi)運(yùn)行，但當(dāng)血管損傷、血流改變或受到化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)血小板被活化而發(fā)生一系列改變。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達(dá)水平的高低來(lái)判斷，F(xiàn)CM測(cè)定血小板膜糖蛋白的表達(dá)情況成為檢查血小板功能的一種新手段[11]。該方法靈敏、特異性高。如果采用全血法測(cè)定，只需微量標(biāo)本，適合于兒童及血小板減少性疾病的患者[12]。 血小板活化時(shí)其質(zhì)膜糖蛋白較其靜止期發(fā)生顯著改變，F(xiàn)CM可以通過(guò)單抗免疫熒光標(biāo)記(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)監(jiān)測(cè)血小板功能及活化情況，有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療。
此外血小板活化時(shí)其細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生很大變化，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測(cè)定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監(jiān)測(cè)的非免疫性指標(biāo)。(2)血小板相關(guān)抗體的測(cè)定：免疫性血小板減少性紫癜病人血漿中可產(chǎn)生血小板自身抗體，結(jié)合在血小板表面，稱為血小板相關(guān)抗體，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標(biāo)記被測(cè)血小板，F(xiàn)CM可以測(cè)定血小板相關(guān)抗體含量。直接法檢測(cè)血小板表面的相關(guān)抗體，間接法可測(cè)定血清中的相關(guān)抗體。該方法用于該病的診斷及治療監(jiān)測(cè)，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
質(zhì)量控制
一、流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)
流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)包括流路的穩(wěn)定性、光路的穩(wěn)定性、多色標(biāo)記熒光顏色補(bǔ)償、光電倍增管轉(zhuǎn)換的線性和穩(wěn)定性。對(duì)儀器的校準(zhǔn)主要是利用標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行監(jiān)測(cè)。聚苯乙烯可以被做成各種大小的微球，也可被熒光標(biāo)記或者擁有定量免疫球蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。這種制成固定熒光強(qiáng)度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成為流式質(zhì)控中的一個(gè)常用的標(biāo)準(zhǔn)品。
二、實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程的質(zhì)控
1、樣本的質(zhì)量控制
用于流式分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、組織活檢物、漿膜腔積液、腦脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物）、細(xì)針穿刺物等等。樣本的條件控制可能是免疫表型分析質(zhì)控最困難的環(huán)節(jié)之一。每種樣本都有不同的采集、保存、運(yùn)輸和制備要求。首先，觀測(cè)樣本外觀：有嚴(yán)重溶血、凝聚或壞死的樣本應(yīng)棄用。
第二，單細(xì)胞懸液的獲?。和庵苎凸撬璐┐桃簽樘烊粏渭?xì)胞懸液；活檢組織常用機(jī)械分離和酶消化兩種方法。不同的實(shí)驗(yàn)要求適用不同的方法。對(duì)于需要進(jìn)行膜抗原標(biāo)記的，不僅是要獲得足夠的單細(xì)胞懸液，還要盡量保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性，機(jī)械法較適用。只需進(jìn)行細(xì)胞周期或DNA倍體分析的，在機(jī)械法的基礎(chǔ)上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）較適用。
第三，抗凝劑的選擇：外周血標(biāo)本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標(biāo)本做白細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝；對(duì)于血小板分析的實(shí)驗(yàn)，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相對(duì)大量的ACD會(huì)通過(guò)改變pH而影響骨髓細(xì)胞活性問(wèn)題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。
第四，樣本的保存：理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通?？杀４嬷?8-72小時(shí)/室溫（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時(shí)/室溫（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小時(shí)/室溫（16-25）；對(duì)于只作胞內(nèi)染色的樣本，可固定細(xì)胞以長(zhǎng)期保存。但此“固定－染色”的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式。
第五，去除紅細(xì)胞的方法：紅細(xì)胞裂解法，操作簡(jiǎn)單、快、并最可能保持原始標(biāo)本的白細(xì)胞分布。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認(rèn)：（1）抗原性不被溶血過(guò)程改變；（2）溶血?jiǎng)┍粡氐紫慈?，?xì)胞和抗體結(jié)合的動(dòng)力反應(yīng)未受影響；（3）所用溶血?jiǎng)┎缓潭▌駝t會(huì)影響細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié)果。密度梯度離心法，靶細(xì)胞回收較好并可能得到富集，同時(shí)去除紅細(xì)胞、碎片等，但費(fèi)時(shí)，某些重要細(xì)胞群體可能被選擇性丟失。
第六，細(xì)胞與抗體的比例：廠家推薦的抗體用量通常是假定靶細(xì)胞數(shù)量在5X105 ~1x106范圍內(nèi)。有些標(biāo)本沒(méi)有足夠的細(xì)胞，有些則由于細(xì)胞量大，正常濃度下的抗體相對(duì)過(guò)量或不足，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)不同于廠家推薦的方法，調(diào)整細(xì)胞與抗體用量，得到最適的細(xì)胞/抗體比例。
第七，細(xì)胞活性的鑒定：死細(xì)胞對(duì)許多抗體均有很強(qiáng)的非特異性染色，這就使樣本細(xì)胞活性檢測(cè)變得非常重要，尤其是經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸和儲(chǔ)存的樣本。檢測(cè)的方法通常有兩種：（1）實(shí)時(shí)的流式檢測(cè)：利用熒光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放線菌素D（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）進(jìn)行死細(xì)胞染色，而活細(xì)胞拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢(shì)是細(xì)胞表面標(biāo)志和活性分析可同時(shí)進(jìn)行。尤其適用于高度壞死的樣本。7-AAD最常用，因?yàn)樵?88nm激發(fā)下，其最大發(fā)射光在670nm左右，適合與FITC 或PE進(jìn)行多色標(biāo)記。但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，7AAD會(huì)在固定的細(xì)胞群體重新分配，死活細(xì)胞的區(qū)分變得困難。因此，對(duì)于染色并在固定后12小時(shí)以上分析的標(biāo)本，最好用EMA。EMA與死細(xì)胞DNA穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合保證了長(zhǎng)時(shí)間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。（2）手工檢測(cè)：使用Trypan blue 或其他細(xì)胞活性染料。（3）使用專門的儀器進(jìn)行檢測(cè)。如Vi-cell.
2、選擇和確定單抗組合
流式分析最基本的試劑就是抗體。所選抗體的好壞直接影響結(jié)果。影響抗體特性的因素很多，如F/P比值、亞型、全長(zhǎng)或片段、種宿來(lái)源、標(biāo)記熒光種類等等。而且，有CD分類號(hào)的300多種單抗和大量沒(méi)有CD分類號(hào)的單抗使抗體的選擇更加困難。一般，選擇抗體組合遵循以下基本原則：1）所選的抗體組合應(yīng)足夠?qū)?，可以鑒別樣本中的所有細(xì)胞亞群包括正常和異常群體。2）對(duì)表達(dá)少的抗原應(yīng)盡可能選擇熒光強(qiáng)度強(qiáng)的熒光素標(biāo)記。3）了解不同抗體的細(xì)胞反應(yīng)譜，以及染色模式。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇抗體。因?yàn)橄嗤珻D編號(hào)的抗體可能識(shí)別不同的抗原決定簇。4）抗體的多種組合可能相互影響與抗原的結(jié)合（如通過(guò)空間構(gòu)型的阻礙），所以對(duì)所用抗體組合，應(yīng)先了解每個(gè)抗體在對(duì)照細(xì)胞上單色標(biāo)記的表達(dá)情況。5）對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)盡量選擇體外診斷（IVD）試劑和分析特異性（ASR）試劑，而僅供研究用（RUO）試劑一般不能用于體外診斷實(shí)驗(yàn)。在我國(guó)，用于體外診斷的試劑還必須取得國(guó)內(nèi)的SDA認(rèn)證。這樣，一個(gè)抗體組合內(nèi)的抗體可能來(lái)源不同的公司，有不同的濃度、不同的亞型、不同F(xiàn)/P值，可能均需要自身的同型對(duì)照，而實(shí)際上，這是非常困難的。那么，盡量選擇同一家公司的試劑可以減少上述的干擾。對(duì)于臨床上常見(jiàn)的流式檢測(cè)項(xiàng)目，所需的試劑組合基本都有參考或推薦的抗體組合。
如，T細(xì)胞亞群檢測(cè)的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）檢測(cè)的CD55、CD59；血小板無(wú)力癥（GT）檢測(cè)的CD41、CD61等等。但對(duì)于白血病/淋巴瘤免疫分型，國(guó)際上迄今為止也沒(méi)有統(tǒng)一的抗體組合。在2000年國(guó)際細(xì)胞分析學(xué)會(huì)（ISAC）大會(huì)上，臨床血細(xì)胞計(jì)數(shù)協(xié)會(huì)組織了一次國(guó)際專家會(huì)議，以期對(duì)檢測(cè)血液淋巴系統(tǒng)腫瘤所需最少、最有效的單抗數(shù)達(dá)成共識(shí)。75%與會(huì)者一致認(rèn)為，對(duì)于慢性淋巴系統(tǒng)增殖性疾病（CLD）有9種單抗：CD5,CD19, κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45對(duì)初診來(lái)說(shuō)是最基本的。淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16種單抗。對(duì)于急性白血?。ˋL），75%的與會(huì)者認(rèn)為大約13-15種單抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，對(duì)初步鑒別白血病系列是必需的。其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能對(duì)某些病例有用。幾乎所有的投票者都認(rèn)為，要對(duì)急性白血病完善分類所需單抗的恰當(dāng)數(shù)量平均為20-24種。但這些抗體之間組合也是一大難題，目前也無(wú)統(tǒng)一規(guī)定（如表二）。大會(huì)多數(shù)發(fā)言者(11/13)指出，對(duì)已確診病人的監(jiān)護(hù)和分期來(lái)說(shuō)，僅需較少單抗。
抗體的質(zhì)量控制是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？贵w的質(zhì)量包括其特異性、靈敏度、精密度。對(duì)這一些，一些商業(yè)化的公司對(duì)常用單抗的檢驗(yàn)均推出了一系列質(zhì)控物。如BECKMAN COULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（見(jiàn)表一）。
3、染色方法
細(xì)胞表面染色：大多數(shù)免疫表型分析均采用此方法。但由于許多抗原也同時(shí)存在細(xì)胞內(nèi)，所以在細(xì)胞表面抗原檢測(cè)時(shí)應(yīng)特別注意保持細(xì)胞膜的完整以保證檢測(cè)的特異性。表面標(biāo)記又分溶血前標(biāo)記和溶血后標(biāo)記。若紅細(xì)胞對(duì)標(biāo)記有影響或血漿成分對(duì)標(biāo)記有影響的，適合溶血后標(biāo)記，但要注意溶血?jiǎng)┠た乖挠绊懀?，溶血?jiǎng)┮话悴缓潭▌?。如免疫球蛋白輕鏈檢測(cè)和陣發(fā)性血紅蛋白尿的檢測(cè)等。
細(xì)胞內(nèi)染色：有些胞內(nèi)抗原的檢測(cè)對(duì)白血病的免疫分型尤為重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD79a 。胞內(nèi)染色的關(guān)鍵是使細(xì)胞膜通透，把抗體或核酸染料導(dǎo)入胞內(nèi)而不影響細(xì)胞骨架的完整性。還要保證固定和透膜的步驟不影響有關(guān)抗原與相應(yīng)抗體的結(jié)合力和核酸與染料的結(jié)合。某些適用于胞內(nèi)染色的試劑可能不適于表面標(biāo)記分析。通常胞內(nèi)染色不能與細(xì)胞活性的檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，除非用EMA的方法。對(duì)于胞內(nèi)染色，所用的熒光素應(yīng)足夠小到能穿透到胞膜內(nèi)。對(duì)于某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）為活細(xì)胞染料，無(wú)需固定或透膜。
胞膜和胞內(nèi)染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內(nèi)染色，最后是DNA染色。
三、數(shù)據(jù)的獲取和分析
流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)的獲取必須是在儀器性能的校準(zhǔn)均合格的基礎(chǔ)上進(jìn)行。由于流式細(xì)胞儀是基于對(duì)散射光信號(hào)和熒光信號(hào)進(jìn)行分析的儀器，因此，儀器散射光和熒光信號(hào)的光電倍增管電壓、增益、顏色補(bǔ)償?shù)葏?shù)的設(shè)定直接影響結(jié)果。同型對(duì)照的設(shè)定尤為重要。同型對(duì)照是指與單抗種宿來(lái)源相同、亞型相同、標(biāo)記熒光素相同的未免疫動(dòng)物的免疫球蛋白。同時(shí)考慮濃度、F/P值盡量相同，這樣陽(yáng)性閾值的界定才比較準(zhǔn)確，特別是對(duì)于弱表達(dá)抗原陽(yáng)性率的測(cè)定。而DNA倍體分析中參照物的設(shè)定非常重要，一般雞紅細(xì)胞作為內(nèi)參照物。為了結(jié)果的可靠性，對(duì)獲取的細(xì)胞量至少應(yīng)在10000-20000個(gè)。但不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)于獲取的細(xì)胞量要求一般是不一樣的，如DNA倍體分析，至少應(yīng)獲取10000個(gè)細(xì)胞；微小殘留病灶（MRD）的檢測(cè)，要求達(dá)到10-4數(shù)量級(jí)水平，則應(yīng)至少分析100000個(gè)細(xì)胞干細(xì)胞移植中CD34的檢測(cè)，應(yīng)至少獲取100個(gè)CD34陽(yáng)性細(xì)胞或75000個(gè)有核細(xì)胞。
對(duì)于獲取的數(shù)據(jù)，應(yīng)保存在listmode文件中，便于分析。設(shè)門（gating）對(duì)于流式數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要。設(shè)門實(shí)際就是確定分析區(qū)域。在DNA倍體分析中，設(shè)門實(shí)際就是圈定單個(gè)細(xì)胞，排除粘連細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞成分單一的標(biāo)本（如培養(yǎng)細(xì)胞），設(shè)門比較簡(jiǎn)單。但對(duì)于成分復(fù)雜的標(biāo)本（如骨髓）而言，準(zhǔn)確的設(shè)門就不那么簡(jiǎn)單。前向散射光（FS）與側(cè)向散射光（SS）設(shè)門干擾因素較多，目前，越來(lái)越多的被免疫標(biāo)記物加散射光設(shè)門所取代。如，CD45/SS設(shè)門已成為白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34檢測(cè)、MRD監(jiān)測(cè)最佳的設(shè)門方法；CD19/SS設(shè)門對(duì)于成熟B淋系增生性疾病分析非常適用。
在數(shù)據(jù)分析中，百分率、熒光強(qiáng)度、DNA指數(shù)（DI）、多少個(gè)/ul是我們報(bào)告中常用的。百分率主要適用于檢驗(yàn)指標(biāo)集中在細(xì)胞有無(wú)的數(shù)量變化。如T細(xì)胞亞群檢測(cè)、網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)等；熒光強(qiáng)度主要適用于檢驗(yàn)指標(biāo)的變化集中在細(xì)胞上抗原量的多少。如血小板無(wú)力癥（GT）的檢測(cè)、慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）CD20的變化等。DI用于DNA倍體分析。而艾滋病劃分中外周血CD4的絕對(duì)定量、OKT3治療監(jiān)測(cè)中CD3的絕對(duì)定量、干細(xì)胞移植中的CD34的定量等等，最終都以多少個(gè)/ul的濃度形式表示出來(lái)。對(duì)于白血病/淋巴瘤免疫分型結(jié)果的分析，以前基本上都是以百分率的形式報(bào)告臨床，但單純的百分率結(jié)果并不能完整的反映腫瘤細(xì)胞的特性。因?yàn)?0%人為認(rèn)定的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)忽略了低于20%的弱陽(yáng)性結(jié)果，以及忽略了陽(yáng)性結(jié)果之間熒光強(qiáng)弱的差別，而這一切對(duì)于白血病/淋巴瘤的診斷和分型卻非常重要。目前，大多主張以文字描述抗原有無(wú)和強(qiáng)弱的報(bào)告方式，廢棄百分率的報(bào)告形式。
四、臨床檢驗(yàn)的分析過(guò)程的質(zhì)量評(píng)價(jià)
質(zhì)量控制也必須重視檢驗(yàn)方法學(xué)的選擇和評(píng)價(jià)。任何一次實(shí)驗(yàn)都一定有誤差，在一定意義上可以將誤差分為實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的系統(tǒng)誤差及除此之外的隨機(jī)誤差。質(zhì)量控制的方法和手段都只能減少或消除隨機(jī)誤差，但不影響系統(tǒng)誤差。要使檢驗(yàn)結(jié)果的誤差控制在臨床可接受的低水平或者允許的誤差范圍內(nèi)，必須使用總誤差水平符合臨床要求的檢驗(yàn)方法（包括儀器、試劑、具體操作方法等），才能保證檢驗(yàn)結(jié)果在質(zhì)量控制下符合臨床要求。臨床檢驗(yàn)質(zhì)量控制的目的，是監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)重要的誤差時(shí)，用適當(dāng)?shù)姆椒ň娣治鋈藛T。一般說(shuō)來(lái)，檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的方法是測(cè)定質(zhì)控物，最通用做法是將質(zhì)控品和病人一起進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)，了解檢驗(yàn)質(zhì)量則是將質(zhì)控品測(cè)定的結(jié)果畫在控制圖上，觀測(cè)控制結(jié)果是否超過(guò)控制限來(lái)決定失控與否。
在開(kāi)始使用質(zhì)控物的第一個(gè)月內(nèi)，檢驗(yàn)人員每天將質(zhì)控物隨機(jī)插入病人標(biāo)本中進(jìn)行檢驗(yàn)項(xiàng)目的測(cè)定。月末對(duì)當(dāng)月的測(cè)定結(jié)果（n≥20）做簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)，求出均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s。若檢驗(yàn)結(jié)果的分布接近正態(tài)分布，結(jié)果的分布即可用均值和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)描述。這就意味著95.5%的結(jié)果在x+2s范圍內(nèi),99.7%的結(jié)果在x+3s范圍內(nèi)。為便于觀察質(zhì)控結(jié)果，及時(shí)了解有何失效情況，常使用質(zhì)控圖。
按照正態(tài)分布規(guī)律：1)所有測(cè)定值應(yīng)均勻分布于均值兩側(cè)，不應(yīng)有明顯不均之感；2)質(zhì)控品測(cè)定值應(yīng)有95.5%的可能性在x±2s范圍之內(nèi)； 3)不應(yīng)有連續(xù)6次以上的結(jié)果落于平均值的一側(cè)；4)不能有連續(xù)5次以上的結(jié)果有逐漸增高或降低的趨勢(shì)性變化;5)不應(yīng)有連續(xù)兩次結(jié)果在x±2s范圍之外； 6)沒(méi)有一次結(jié)果在x±3s范圍之外。
如果不符合上述規(guī)律，則說(shuō)明結(jié)果失控。只有證實(shí)當(dāng)天質(zhì)控結(jié)果在控制之內(nèi),對(duì)當(dāng)天的臨床檢驗(yàn)才能發(fā)出結(jié)果。一旦出現(xiàn)失控,則須查明原因，重新檢驗(yàn)。對(duì)有1次檢驗(yàn)結(jié)果超出均數(shù)2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差范圍，提示警告。同批實(shí)驗(yàn)中2個(gè)質(zhì)控品的結(jié)果之差值超過(guò)4s，也是失控規(guī)則之一，提示存在隨機(jī)誤差。連續(xù)4次質(zhì)控結(jié)果同方向超出均數(shù)1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差范圍，也是失控規(guī)則之一，提示存在系統(tǒng)誤差。
五、室間質(zhì)量評(píng)價(jià)
開(kāi)展內(nèi)部的質(zhì)量控制使實(shí)驗(yàn)的受控項(xiàng)目達(dá)到一定的精密度。臨床上往往只對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可重復(fù)較敏感，若實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較穩(wěn)定的系統(tǒng)誤差，臨床和實(shí)驗(yàn)室一般不易察覺(jué)，因此內(nèi)部的質(zhì)量控制還在于控制結(jié)果的不精密度。由專門機(jī)構(gòu)定期向臨床實(shí)驗(yàn)室分發(fā)質(zhì)控品,要求各單位檢測(cè)后返回測(cè)定結(jié)果，經(jīng)過(guò)整理和統(tǒng)計(jì)，以數(shù)據(jù)和報(bào)告形式反映各實(shí)驗(yàn)室間及各分析方法間的差異，根據(jù)各單位測(cè)定結(jié)果與靶值的離散程度，計(jì)算出該實(shí)驗(yàn)室所的分?jǐn)?shù)，及時(shí)反饋給參加者，便于改進(jìn)工作。這就是室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的基本形式。室間質(zhì)量評(píng)價(jià)主要是控制實(shí)驗(yàn)室工作的不準(zhǔn)確度，是對(duì)室內(nèi)質(zhì)量控制的補(bǔ)充。我國(guó)于2000年，由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心開(kāi)始組織開(kāi)展臨床流式細(xì)胞術(shù)室間質(zhì)評(píng)。現(xiàn)已開(kāi)展了T細(xì)胞亞群檢測(cè)和CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)的室間質(zhì)評(píng)。

血清抗體干凍粉用何稀釋?。ㄊ侨ルx子水，PBS,還是生理鹽水啊 ）

你可以先加少量的水，比如100ul或者1ml的水溶解。溶解完后，稀釋可以用PBS或者專門的抗體稀釋液。

如何用流式檢測(cè)小鼠外周血中T細(xì)胞的凋亡

中性粒細(xì)胞(PMN)是機(jī)體防御系統(tǒng)的主要組成部分，能吞噬和殺滅多種致病原。致病原與血清中的特異性抗體(IgG)結(jié)合后,通過(guò)IgG的Fc部分與PMN表面的受體——FcγRⅢ(CD16b)相結(jié)合，從而被吞噬。FcγRⅢ有a、b兩種類型，F(xiàn)cγRⅢa(CD16a)是一種跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb(CD16b)是一種糖肌醇磷脂蛋白(GPI-錨蛋白)［1］。近年發(fā)現(xiàn)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)患者在血細(xì)胞表面缺失各種特異的GPI-錨蛋白，CD16b正是這類蛋白之一。為探討PMN表面CD16b的缺失與PMN釋放氧自由基殺菌功能的關(guān)系，將我們的研究報(bào)告如下。 材料和方法 1 標(biāo)本采集 正常人