同一根色譜柱，在不同的色譜儀器上，采用相同的色譜條件，但是雜質(zhì)的分離度差異太大，比如A和B兩種物質(zhì)

如果其他條件完全相同，也就是你所說(shuō)的死體積的問(wèn)題。管路上都差不多，主要是檢測(cè)池的問(wèn)題。如果儀器1檢測(cè)池較小，進(jìn)樣量比較小的話，會(huì)有你說(shuō)的完全分離的情況。而換成了儀器2，檢測(cè)池較大，會(huì)出現(xiàn)樣品分散的情況，導(dǎo)致分不開(kāi)。

有誰(shuí)知道色譜柱壞了，然后我把它倒過(guò)來(lái)用了大概半個(gè)月，這根色譜柱還有用嗎？還能填充料嗎？

首先從你所說(shuō)的壞了，倒過(guò)來(lái)用大概半個(gè)月來(lái)判斷，應(yīng)該是倒過(guò)來(lái)之后的效果你還能接受并且一直在這么用。 由此推測(cè)，你所說(shuō)的壞了可能是柱頭塌陷導(dǎo)致峰型擴(kuò)散，倒用之后峰型改善；或者是雜質(zhì)堵塞柱頭，倒用之后雜質(zhì)被沖出色譜柱。 一般來(lái)說(shuō)，色譜柱倒用可能導(dǎo)致床層斷裂，從而徹底壞掉。所以，趁著現(xiàn)在柱子還沒(méi)壞之前，降低你的流速到正常流速的1/10，并長(zhǎng)時(shí)間沖洗色譜柱（20-30h），之后再正用，可能還能解決之前峰型擴(kuò)散的問(wèn)題。 或者，干脆打開(kāi)柱頭補(bǔ)上一點(diǎn)填料，還能修補(bǔ)到之前70%左右的柱效。

兩種不同的流動(dòng)相用同一根色譜柱對(duì)色譜柱有什么影響

這主要看色譜的使用說(shuō)明。 比如通常的C18色譜柱來(lái)說(shuō)，只要PH在2-8的有機(jī)相和水相就可以做為流動(dòng)相使用。在使用過(guò)程中主要是注意一方面在極性差別大一些流動(dòng)相替換時(shí)，要防止互溶性不好的問(wèn)題，有時(shí)用緩沖鹽，直接換成極性非常弱的流動(dòng)相時(shí)防止鹽析現(xiàn)象。還有，就是防止機(jī)械雜質(zhì)堵柱子的問(wèn)題。 至于用什么樣的流動(dòng)相，只要符合柱子說(shuō)明書(shū)的流動(dòng)相，都 可以使用，相互替換使用也沒(méi)關(guān)系 。

液相更換色譜柱要注意那些事項(xiàng)?

（1）如果更換色譜柱涉及到不同分離模式（正相、反相、離子對(duì)、離子交換等）之間的轉(zhuǎn)換，要注意不同色譜柱類(lèi)型之間的流動(dòng)相體系的相溶性。具體見(jiàn)本書(shū)其它相關(guān)內(nèi)容。 （2）換柱前，先確認(rèn)儀器上現(xiàn)有的色譜柱已經(jīng)沖洗干凈，且柱內(nèi)流動(dòng)相適合保存色譜柱。然后停泵，拆下舊柱，注意將封口螺絲擰好。 （3）在接新柱時(shí)，最好出口端先不接檢測(cè)器。設(shè)定一個(gè)小流速，注意柱子的流向，不能接反（除非特意）。觀察流動(dòng)相流出色譜柱后柱壓的變化。一定要注意流動(dòng)相應(yīng)與儀器系統(tǒng)中原來(lái)的流動(dòng)相互溶。 （4）估計(jì)柱內(nèi)保存液基本流出色譜柱，且柱壓基本穩(wěn)定后再接上檢測(cè)器，這樣既可排凈保存液，也排出了可能會(huì)留在柱中的氣泡。連接管線的接頭螺絲一定要擰

色譜柱的注意事項(xiàng)

色譜柱 的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。
①　避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。
②　應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?br />③　一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
④　選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
⑤　避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
⑥　經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200μl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類(lèi)脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。
陽(yáng)離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦　保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
⑧　色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開(kāi)柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿(mǎn)色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。
每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開(kāi)機(jī)沖洗15分鐘。