表觀遺傳的研究成果

核小體結(jié)構(gòu)的存在為染色質(zhì)包裝提供了便利，但DNA與組蛋白八聚體緊密結(jié)合卻為基因的表達(dá)設(shè)置了障礙，要打破這一障礙獲得有活性的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，可通過染色質(zhì)重塑來實(shí)現(xiàn)。染色質(zhì)重塑是指在能量驅(qū)動下核小體的置換或重新排列。它改變了核小體在基因啟動子區(qū)的排列，增加了基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置和啟動子的可接近性。染色質(zhì)重塑的發(fā)生和組蛋白N端尾巴修飾密切相關(guān)，尤其是對組蛋白H3和H4的修飾。修飾直接影響核小體的結(jié)構(gòu)，并為其它蛋白提供了和DNA作用的結(jié)合位點(diǎn)。染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾均由各自特異的復(fù)合物來完成，兩者發(fā)生的先后順序與啟動子序列的特異性有關(guān)；后與啟動子結(jié)合的復(fù)合物有助于維持兩個(gè)復(fù)合物與啟動子的穩(wěn)定結(jié)合，且兩復(fù)合物又可相互加強(qiáng)對方的功能。染色質(zhì)重塑復(fù)合物、組蛋白修飾酶的突變均和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA甲基化、DNA重組、細(xì)胞周期、DNA的復(fù)制和修復(fù)的異常相關(guān)，這些異?？梢砸鹕L發(fā)育畸形，智力發(fā)育遲緩，甚至導(dǎo)致癌癥。
ATP依賴的染色質(zhì)重塑與人類疾病
染色質(zhì)重塑復(fù)合物依靠水解ATP提供能量來完成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，根據(jù)水解ATP的亞基不同，可將復(fù)合物分為SWI/SNF復(fù)合物、ISW復(fù)合物以及其它類型的復(fù)合物。這些復(fù)合物及相關(guān)的蛋白均與轉(zhuǎn)錄的激活和抑制、DNA的甲基化、DNA修復(fù)以及細(xì)胞周期相關(guān)。
ATRX、ERCC6、SMARCAL1均編碼與SWI/SNF復(fù)合物相關(guān)的ATP酶。ATRX突變引起DNA甲基化異常導(dǎo)致數(shù)種遺傳性的智力遲鈍疾病如：X連鎖α-地中海貧血綜合征、Juberg-Marsidi綜合征、Carpenter-Waziri綜合征、Sutherland-Haan綜合征和Smith-Fineman-Myers綜合征，這些疾病與核小體重新定位的異常引起的基因表達(dá)抑制有關(guān)。ERCC6的突變將導(dǎo)致Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal綜合征和B型Cockayne綜合征。前者表現(xiàn)為出生后發(fā)育異常、神經(jīng)退行性變、進(jìn)行性關(guān)節(jié)攣縮、夭折；后者表現(xiàn)出紫外線敏感、骨骼畸形、侏儒、神經(jīng)退行性變等癥狀。這兩種病對紫外誘導(dǎo)的DNA損傷缺乏修復(fù)能力，表明ERCC6蛋白在DNA修復(fù)中有重要的作用。SMARCAL1的突變導(dǎo)致Schimke免疫性骨質(zhì)發(fā)育異常，表現(xiàn)為多向性T細(xì)胞免疫缺陷，臨床癥狀表明SMARCAL1蛋白可能調(diào)控和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因的表達(dá)。BRG1、SMARCB1和BRM編碼SWI/SNF復(fù)合物特異的ATP酶，這些酶通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)使成細(xì)胞纖維瘤蛋白（Retinoblastoma protein,RB蛋白）順利的行使調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制生長發(fā)育以及維持基因失活狀態(tài)的功能，這三個(gè)基因的突變可導(dǎo)致腫瘤形成。
組蛋白乙酰化、去乙酰化與人類疾病
組蛋白乙?；c基因活化以及DNA復(fù)制相關(guān)，組蛋白的去乙?；突虻氖Щ钕嚓P(guān)。乙?；D(zhuǎn)移酶（HATs）主要是在組蛋白H3、H4的N端尾上的賴氨酸加上乙酰基，去乙酰化酶（HDACs）則相反，不同位置的修飾均需要特定的酶來完成。乙?；讣易蹇勺鳛檩o激活因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，參與DNA損傷修復(fù)，還可作為DNA結(jié)合蛋白。去乙?；讣易鍎t和染色體易位、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因沉默、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和增殖以及細(xì)胞凋亡相關(guān)。
CREB結(jié)合蛋白（CREB binding protein,CBP）、E1A結(jié)合蛋白p300(E1A binding protein p300,EP300）和鋅指蛋白220(zinc finger 220,ZNF220）均為乙?；D(zhuǎn)移酶。CBP是cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白的輔激活蛋白，通過乙酰化組蛋白使和cAMP應(yīng)答元件作用的啟動子開始轉(zhuǎn)錄，它的突變導(dǎo)致Rubinstein Taybi綜合征，患者智力低下、面部畸形、姆指和拇趾粗大、身材矮小。CBP和EP300均可抑制腫瘤的形成，在小鼠瘤細(xì)胞中確定了CBP的突變，在結(jié)腸和乳房瘤細(xì)胞系中確定了EP300的突變，另外ZNF220異常和人的急性進(jìn)行性髓性白血病相關(guān)。
如果突變導(dǎo)致錯(cuò)誤的激活去乙?；富蝈e(cuò)誤的和去乙?；赶嗷プ饔?，將可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。甲基化CpG-結(jié)合蛋白-2(methyl cytosine binding protein-2,MeCP2）可募集去乙?；傅郊谆腄NA區(qū)域，使組蛋白去乙酰化導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮，MeCP2的突變導(dǎo)致Rett綜合征，患者出生即發(fā)病、智力發(fā)育遲緩、伴孤獨(dú)癥。若阻礙去乙?；傅墓δ埽瑒t可抑制癌細(xì)胞的增殖和分化，可用于急性早幼粒細(xì)胞性白血病，急性淋巴細(xì)胞性白血病和非何杰金氏淋巴瘤的治療。
染色質(zhì)重塑異常引發(fā)的人類疾病是由于重塑復(fù)合物中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變，導(dǎo)致染色質(zhì)重塑失敗，即核小體不能正確定位，并使修復(fù)DNA損傷的復(fù)合物，基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置等不能接近DNA，從而影響基因的正常表達(dá)。如果突變導(dǎo)致抑癌基因或調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白出現(xiàn)異常將導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。乙?；傅耐蛔儗?dǎo)致正?；虿荒鼙磉_(dá)，去乙?；傅耐蛔兓蛞恍┖腿ヒ阴；赶嚓P(guān)的蛋白的突變使去乙?；稿e(cuò)誤募集將引發(fā)腫瘤等疾病。 基因組印記是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時(shí)發(fā)生了修飾，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達(dá)特性，這種修飾常為DNA甲基化修飾，也包括組蛋白乙酰化、甲基化等修飾。在生殖細(xì)胞形成早期，來自父方和母方的印記將全部被消除，父方等位基因在精母細(xì)胞形成精子時(shí)產(chǎn)生新的甲基化模式，但在受精時(shí)這種甲基化模式還將發(fā)生改變；母方等位基因甲基化模式在卵子發(fā)生時(shí)形成，因此在受精前來自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式。發(fā)現(xiàn)的印記基因大約80%成簇，這些成簇的基因被位于同一條鏈上的順式作用位點(diǎn)所調(diào)控，該位點(diǎn)被稱做印記中心（imprinting center,IC）。印記基因的存在反映了性別的競爭，從發(fā)現(xiàn)的印記基因來看，父方對胚胎的貢獻(xiàn)是加速其發(fā)育，而母方則是限制胚胎發(fā)育速度，親代通過印記基因來影響其下一代，使它們具有性別行為特異性以保證本方基因在遺傳中的優(yōu)勢。
印記基因的異常表達(dá)引發(fā)伴有復(fù)雜突變和表型缺陷的多種人類疾病。研究發(fā)現(xiàn)許多印記基因?qū)ε咛ズ吞撼錾蟮纳L發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，對行為和大腦的功能也有很大的影響，印記基因的異常同樣可誘發(fā)癌癥。
基因組印記與臍疝-巨舌-巨人癥綜合征（BWS）
BWS患者表現(xiàn)為胚胎和胎盤過度增生，巨舌，巨大發(fā)育，兒童期易發(fā)生腫瘤。該病主要是由11號染色體上的IGF2和CDKN1C兩個(gè)印記基因的錯(cuò)誤表達(dá)引發(fā)，IGF2為父本表達(dá)的等位基因，CDKN1C為母本表達(dá)的等位基因。父本單親二體型（uniparental disomies,UPDs）是引發(fā)BWS的主要原因，即IGF2基因雙倍表達(dá)，CDKN1C基因不表達(dá)；次要原因是母本的CDKN1C等位基因發(fā)生突變[22]；極少數(shù)病例是由于母本的染色體發(fā)生移位造成CDKN1C基因失活和（或）造成母本的IGF2基因表達(dá)。其它一些印記基因在胚胎發(fā)育過程中的過量或缺失表達(dá)也可導(dǎo)致類似于BWS的綜合征，如原來母本表達(dá)的IPL基因的不表達(dá)或母本的ASCL2基因逃避印記都將導(dǎo)致胚胎的過度發(fā)育。這表明父本表達(dá)的等位基因?qū)ε咛サ纳L有促進(jìn)作用，而母本表達(dá)的等位基因?qū)ε咛サ陌l(fā)育起到限制作用。
基因組印記與Prader-Willi/Angelman綜合征（PWS/AS）
PWS表現(xiàn)為肥胖、身材矮小和輕度智力發(fā)育遲緩；AS表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、過度活躍、嚴(yán)重智障、少語、表情愉悅，這兩種疾病都和神經(jīng)功能失調(diào)相關(guān)。PWS是由于突變導(dǎo)致父本印記基因在大腦中高表達(dá)所致，如SNPNP基因高表達(dá)；AS是由于母本的UBE3A基因的缺失或受到抑制所致，該基因編碼泛素蛋白連接酶并在腦中表達(dá)。父本表達(dá)的SNRNP基因的微缺失可導(dǎo)致PWS，而在其上游進(jìn)一步缺失則可導(dǎo)致AS，這說明這兩個(gè)區(qū)域就是印記中心所在的位置。如果缺失父本染色體上的PWS印記中心將導(dǎo)致SNRNP基因以及附近的父本表達(dá)的等位基因被抑制，而缺失父本染色體上的AS印記中心則沒什么變化，但若缺失母本染色體上的AS印記中心將導(dǎo)致UBE3A被抑制而導(dǎo)致AS。
基因組印記與癌癥
印記丟失不僅影響胚胎發(fā)育并可誘發(fā)出生后的發(fā)育異常，從而導(dǎo)致癌癥發(fā)生。如果抑癌基因有活性的等位基因失活便提高了發(fā)生癌癥的幾率，例如IGF2基因印記丟失將導(dǎo)致多種腫瘤，如Wilm’s 瘤。和印記丟失相關(guān)的疾病還有成神經(jīng)細(xì)胞瘤，急性早幼粒細(xì)胞性白血病，橫紋肌肉瘤和散發(fā)的骨肉瘤等。
與基因組印記相關(guān)的疾病常常是由于印記丟失導(dǎo)致兩個(gè)等位基因同時(shí)表達(dá)，或突變導(dǎo)致有活性的等位基因失活所致。調(diào)控基因簇的印記中心發(fā)生突變將導(dǎo)致一系列基因不表達(dá)，引發(fā)復(fù)雜綜合征?；蚪M印記的本質(zhì)仍為DNA修飾和蛋白修飾，所以和印記相關(guān)的蛋白發(fā)生突變也將導(dǎo)致表觀遺傳疾病。 X染色體失活
女性有兩條X染色體，而男性只有一條X染色體，為了保持平衡，女性的一條X染色體被永久失活，這便是“劑量補(bǔ)償”效應(yīng)。哺乳動物雌性個(gè)體的X染色體失活遵循n-1法則，不論有多少條X染色體，最終只能隨機(jī)保留一條的活性。對有多條X染色體的個(gè)體研究發(fā)現(xiàn)有活性的染色體比無活性的染色體提前復(fù)制，復(fù)制的異步性和LINE-1元件的非隨機(jī)分布有可能揭示染色體失活的本質(zhì)[27]。哺乳動物受精以后，X染色體發(fā)生系統(tǒng)變化。首先父本X染色體（paternal X chromosome,Xp）在所有的早期胚胎細(xì)胞中失活，表現(xiàn)為整個(gè)染色體的組蛋白被修飾和對細(xì)胞分裂有抑制作用的Pc-G蛋白（Polycomb group proteins,Pc-G）表達(dá)，然后Xp在內(nèi)細(xì)胞群又選擇性恢復(fù)活性，最后父本或母本X染色體再隨機(jī)失活。
X染色體隨機(jī)失活是X失活中心（X inactivation center,Xic）調(diào)控的。Xic是一個(gè)順式作用位點(diǎn)，包含辨別X染色體數(shù)目的信息和Xist基因，前者可保證僅有一條染色體有活性，但機(jī)制不明，后者缺失將導(dǎo)致X染色體失活失敗。X染色體失活過程為：Xist基因編碼Xist RNA，Xist RNA包裹在合成它的X染色體上，引發(fā)X染色體失活；隨著Xist RNA在X染色體上的擴(kuò)展，DNA甲基化和組蛋白的修飾馬上發(fā)生，這對X染色體失活的建立和維持有重要的作用；失活的染色體依舊持續(xù)合成Xist RNA，維持本身的失活狀態(tài)，但有活性的X染色體如何阻止Xist RNA的結(jié)合機(jī)制還不明確。
與X染色體失活相關(guān)的疾病
和X染色體失活相關(guān)的疾病多是由X染色體的不對稱失活，使攜帶有突變等位基因的X染色體在多數(shù)細(xì)胞中具有活性所致。Wiskott-Aldrich綜合征表現(xiàn)為免疫缺陷、濕疹、伴血小板缺乏癥，該病是由于WASP基因突變所致。因?yàn)槿旧w隨機(jī)失活導(dǎo)致女性為嵌合體，攜帶有50%的正?；颍ǔo癥狀表現(xiàn)，該病患者多為男性。存在女性患病的原因在于不對稱X染色體失活，即攜帶有正常WASP基因的染色體過多失活。但女性體內(nèi)還存在另一種機(jī)制，通過不對稱失活使攜帶有突變基因的X染色體大部分失活。對Pelizaeus-Merzbacher病的研究表明這種機(jī)制的存在，它使帶有突變PLP基因的X染色體傾向于失活。RTT綜合征也和不對稱X染色體失活有關(guān)，攜帶有MeCP2突變基因的女性，X染色體失活時(shí)傾向于使攜帶有發(fā)生突變的等位基因的染色體失活。
即便是失活的X染色體，也有一部分基因可以逃避失活而存在兩個(gè)有活性的等位基因，但逃避失活的等位基因的表達(dá)水平有很大的差異。由于逃避失活而易使一些抑癌基因喪失功能，這是引發(fā)女性癌癥的一個(gè)重要原因。也有一些逃避失活的基因過量表達(dá)而增加某些疾病的易感性，如TIMP1基因隨著年齡的增加表達(dá)量逐漸增加，導(dǎo)致遲發(fā)型疾病。女性易感的自身免疫性疾病也和X染色體失活相關(guān)，因?yàn)榕詾榍逗象w，如果自身免疫性T細(xì)胞不能耐受兩個(gè)X染色體所編碼的抗原，則會導(dǎo)致自身免疫缺陷性疾病，如紅斑狼瘡等。 非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)中的作用
功能性非編碼RNA在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的作用，按照它們的大小可分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。長鏈非編碼RNA在基因簇以至于整個(gè)染色體水平發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用。在果蠅中調(diào)節(jié)“劑量補(bǔ)償”的是roX RNA，該RNA還具有反式調(diào)節(jié)的作用，它和其它的蛋白共同構(gòu)成MSL復(fù)合物，在雄性果蠅中調(diào)節(jié)X染色體活性。在哺乳動物中Xist RNA調(diào)節(jié)X染色體的失活，其具有特殊的模體可和一些蛋白共同作用實(shí)現(xiàn)X染色體的失活。Tsix RNA是Xist RNA的反義RNA，對Tsix起負(fù)調(diào)節(jié)作用，在X染色體隨機(jī)失活中決定究竟哪條鏈?zhǔn)Щ?。air RNA調(diào)節(jié)一個(gè)基因簇的表達(dá)，該基因簇含有3個(gè)調(diào)節(jié)生長的基因。長鏈RNA常在基因組中建立單等位基因表達(dá)模式，在核糖核蛋白復(fù)合物中充當(dāng)催化中心，對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變發(fā)揮著重要的作用。
短鏈RNA在基因組水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其可介導(dǎo)mRNA的降解，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，決定著細(xì)胞的分化命運(yùn)，還對外源的核酸序列有降解作用以保護(hù)本身的基因組。常見的短鏈RNA為小干涉RNA(short interfering RNA,siRNA）和微小RNA(microRNA,miRNA），前者是RNA干擾的主要執(zhí)行者，后者也參與RNA干擾但有自己獨(dú)立的作用機(jī)制。
非編碼RNA與疾病
非編碼RNA對防止疾病發(fā)生有重要的作用。染色體著絲粒附近有大量的轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座子可在染色體內(nèi)部轉(zhuǎn)座導(dǎo)致基因失活而引發(fā)多種疾病甚至癌癥，然而在著絲粒區(qū)存在大量有活性的短鏈RNA，它們通過抑制轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座而保護(hù)基因組的穩(wěn)定性。在細(xì)胞分裂時(shí)，短鏈RNA異常將導(dǎo)致染色體無法在著絲粒處開始形成異染色質(zhì)，細(xì)胞分裂異常，如果干細(xì)胞發(fā)生這種情況可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。siRNA 可在外來核酸的誘導(dǎo)下產(chǎn)生，通過RNA干擾清除外來的核酸，對預(yù)防傳染病有重要的作用。RNA干擾已大量應(yīng)用于疾病的研究為一些重大疾病的治療帶來了新的希望。
非編碼RNA不僅能對整個(gè)染色體進(jìn)行活性調(diào)節(jié)，也可對單個(gè)基因活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，它們對基因組的穩(wěn)定性、細(xì)胞分裂、個(gè)體發(fā)育都有重要的作用。RNA干擾是研究人類疾病的重要手段，通過其它物質(zhì)調(diào)節(jié)RNA干擾的效果以及實(shí)現(xiàn)RNA干擾在特異的組織中發(fā)揮作用是未來RNA干擾的研究重點(diǎn)。

蛋白質(zhì)的甲基化修飾

蛋白質(zhì)的甲基化，作為一種普遍的蛋白質(zhì)修飾方式，涉及到將甲基酶促轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)特定殘基，如賴氨酸或精氨酸。在大鼠肝細(xì)胞核的總蛋白提取物中，約有2%的精氨酸殘基二甲基化。蛋白質(zhì)甲基化與乙?；⒘校鳛槌Ｒ姷谋碛^遺傳修飾，它們經(jīng)常發(fā)生在組蛋白上。甲基化由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供，而賴氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍基充當(dāng)受體。甲基化反應(yīng)也可以發(fā)生在組氨酸的咪唑基、谷氨酰胺和天冬酰胺的酰胺基、半胱氨酸的巰基、半胱氨酸的羧基、谷氨酸和天冬氨酸的側(cè)鏈羧基。
蛋白質(zhì)的甲基化在生物體中扮演著重要角色，包括調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-DNA或蛋白質(zhì)-RNA相互作用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位或酶活性。在組蛋白上至少存在五個(gè)可以被甲基化的精氨酸殘基和六個(gè)賴氨酸殘基。不同位點(diǎn)的甲基化對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正反不同的影響。
蛋白質(zhì)甲基化對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能有顯著影響，盡管它不會改變殘基的總電荷，但甲基的存在會影響其性質(zhì)。例如，精氨酸的甲基化會影響相分離過程，這種過程與多種生理病理現(xiàn)象相關(guān)，如染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、核糖體形成、DNA損傷應(yīng)答以及神經(jīng)退行性疾病等。
在生物大分子通過相分離形成凝聚物過程中，蛋白質(zhì)的甲基化也發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些凝聚物是亞穩(wěn)態(tài)的，可以硬化成粘性液體、凝膠或淀粉樣物質(zhì)。FUS是一個(gè)多功能的DNA/RNA結(jié)合蛋白，參與多種生命過程。然而，F(xiàn)US功能異常會導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病，如ALS和FTLD等。研究表明，精氨酸的甲基化會削弱蛋白質(zhì)間的陽離子-π相互作用，影響其液滴和凝膠狀態(tài)，從而降低液-液相分離過程。
這些研究揭示了蛋白質(zhì)甲基化在生命過程中復(fù)雜而重要的作用，它不僅影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，還與多種生理和病理現(xiàn)象緊密相關(guān)。進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)甲基化機(jī)制及其調(diào)控可能為開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病等疾病的新策略提供線索。

組蛋白甲基化修飾（Histone Lysine Methylation）

染色質(zhì)的精細(xì)調(diào)色板：組蛋白甲基化的作用與動態(tài)平衡 在真核生物的基因舞臺上，組蛋白甲基化（組蛋白H3和H4的N端尾部的賴氨酸或精氨酸被甲基化修飾），這一過程由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMTs）精細(xì)操控，如同藝術(shù)家手中的畫筆，將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基巧妙地添加到DNA的守護(hù)者上。賴氨酸可接納一至三個(gè)甲基，精氨酸則可被加上一或兩個(gè)，這些看似微小的變化，卻在基因表達(dá)的調(diào)色板上產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。
核小體的動態(tài)核心 作為染色質(zhì)的基本組件，核小體由H3-H4和H2A-H2B二聚體構(gòu)成，最初被認(rèn)為是DNA的靜態(tài)框架。然而，現(xiàn)代研究揭示，組蛋白并非靜止不變，它們通過甲基化等翻譯后修飾，參與到細(xì)胞核的多種功能調(diào)控中，尤其是賴氨酸甲基化，成為決定基因組結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)鍵開關(guān)。
賴氨酸甲基化：三種狀態(tài)與命運(yùn)決定 賴氨酸的甲基化狀態(tài)——單、二、三甲基化，如同基因組的密碼，與不同的核活性和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)緊密相連。通過賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（KMTs）的精細(xì)操作和去甲基化酶（KDMs）的調(diào)節(jié)，這些變化在細(xì)胞層面刻畫了基因的開啟與關(guān)閉。
抗癌策略的基石：組蛋白去甲基化酶 其中，一些去甲基化酶，如KDM2/7，擁有抗癌潛力，它們抑制了過度的甲基化，恢復(fù)基因的正常表達(dá)。HMTs和KDMs的特異性識別和作用，共同構(gòu)建了染色質(zhì)調(diào)控的精密網(wǎng)絡(luò)。
組蛋白甲基化：基因表達(dá)的指揮棒 甲基化程度和位置決定了基因的轉(zhuǎn)錄命運(yùn)。H3K4me2、me3和H3K79me3傾向于激活，而H3K9me2、me3、H3K27me2、me3和H4K20me3則抑制，它們還參與DNA修復(fù)，與相關(guān)蛋白形成動態(tài)協(xié)作。
賴氨酸甲基化在性別決定與疾病中的角色 在雌性哺乳動物中，X染色體的去活化過程中，組蛋白H3K9me3、H3K27me3等位點(diǎn)的甲基化至關(guān)重要，它們通過與Xist RNA的結(jié)合，將X染色體塑造成異染色質(zhì)，這一過程的失調(diào)與多種癌癥的發(fā)展緊密相關(guān)。
通過深入理解組蛋白甲基化這一生物化學(xué)機(jī)制，我們得以窺探生命的復(fù)雜性，揭示基因表達(dá)調(diào)控的深層邏輯。賴氨酸甲基化，這一看似微不足道的修飾，實(shí)則在細(xì)胞的每一絲基因活動背后發(fā)揮著至關(guān)重要的角色。

DNA甲基化

DNA的甲基化是在DNA的序列不變的條件下，在其中某些堿基上加上甲基的這樣一個(gè)過程。DNA甲基化的結(jié)果，一般是使甲基化位點(diǎn)的下游的基因表達(dá)量變少。
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族（Dnmts）催化甲基從S-腺嘌呤甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移至胞嘧啶殘基的第五個(gè)碳，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。
（a）Dnmt3a和Dnmt3b是從頭 Dnmts并將甲基（紅色）轉(zhuǎn)移到裸DNA上。
（b）Dnmt1是維持Dnmt并在復(fù)制期間維持DNA甲基化模式。當(dāng)DNA經(jīng)歷半保守復(fù)制時(shí)，親本DNA支架保留原始DNA甲基化模式（灰色）。Dnmt1與復(fù)制灶相關(guān)聯(lián)，并通過在新形成的子鏈（藍(lán)色）上添加甲基（紅色）來精確復(fù)制原始DNA甲基化模式。
DNA甲基化與組蛋白修飾和microRNA（miRNA）一起調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。在真核生物中，DNA與組蛋白結(jié)合，有助于將長鏈DNA包裝到小核區(qū)。將包括甲基化，乙酰化，遍在蛋白化和磷酸化的化學(xué)修飾添加到N-末端組蛋白尾部的三個(gè)特定氨基酸上。這些修飾不僅影響DNA鏈的包裝方式，還影響其轉(zhuǎn)錄活性。松散DNA與組蛋白結(jié)合的組蛋白修飾通常為轉(zhuǎn)錄提供了允許的環(huán)境，而緊密包裝DNA和組蛋白的組蛋白修飾抑制了基因表達(dá)。Dnmts直接與調(diào)節(jié)通常參與基因抑制的組蛋白修飾的酶相互作用。已知Dnmt1和Dnmt3a都與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1結(jié)合，后者通過H3K9上的甲基化來限制基因表達(dá)。此外，Dnmt1和Dnmt3b都可以結(jié)合組蛋白脫乙酰酶，去除組蛋白的乙?；笵NA包裝更緊密，限制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)入。通常，Dnmts與組蛋白修飾酶配合，所述組蛋白修飾酶參與添加和/或剝離組蛋白標(biāo)記，以便在基因區(qū)域上施加抑制狀態(tài)。
用亞硫酸氫鹽來處理DNA。DNA當(dāng)中，沒有甲基化或羥甲基化的C堿基，就會被轉(zhuǎn)化成U堿基。
在弱酸性條件下，亞硫酸氫根會結(jié)合到?jīng)]有甲基化的C堿基的6位。而甲基化了的C堿基不會和亞硫酸氫根發(fā)生這個(gè)反應(yīng)的。然后用堿來處理。結(jié)合了亞硫酸氫根的非甲基化的C，就被脫氨基，并且脫亞硫酸根。然后，就被轉(zhuǎn)化成U堿基。甲基化或者羥甲基化的C堿基還保持了是“C”。
用亞硫酸氫鹽來處理DNA，可以讓99%左右的非甲基化的C堿基變成U。也就是說這種方法的的轉(zhuǎn)化效率非常高，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了99%。
經(jīng)過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的DNA，再經(jīng)過PCR，PCR新合成出來的鏈，U堿基的位置，就會被替換成了“T”。那么在接下來的測序過程中，測到的也是T堿基。而甲基化的C，因?yàn)闆]有被亞硫酸氫鹽所轉(zhuǎn)化，所以，在接下來的測序過程中，被測到的，還是“C”堿基。
甲基化的建庫過程。
第一種，Illumina公司的Truseq DNA建庫方法。
因?yàn)镮llumina Truseq DNA建庫試劑盒當(dāng)中，它所提供的接頭上的C堿基都是已經(jīng)經(jīng)過甲基化修飾了。所以，用這些接頭做出來的文庫，在用亞硫酸氫鹽做轉(zhuǎn)化的過程當(dāng)中，它的（接頭上的）C還是保持是C ，不會被轉(zhuǎn)成U。帶了這些接頭的文庫分子，就可以和測序芯片上的草皮DNA發(fā)生互補(bǔ)雜交。并且進(jìn)一步發(fā)生橋式PCR反應(yīng)。生成測序用的DNA的簇（Cluster）。但是，這個(gè)方法有一個(gè)缺點(diǎn)，就是在用亞硫酸氫鹽處理DNA文庫的時(shí)侯，90%以上的DNA鏈會斷掉。這樣，已經(jīng)建好的文庫，其中90%分子會被破壞掉。也就是說文庫的豐富度就會損失90%以上。它的好處就是，在這個(gè)建庫過程當(dāng)中用的PCR循環(huán)數(shù)較少。所以它PCR擴(kuò)增效率不同，所引起的文庫不均一程度也就較低。也就是我們通常所說的PCR bias較少。
第二種，EpiCentre公司開發(fā)的EpiGnome方法。
第1步，亞硫酸氫鹽先處理DNA，把未甲基化的C都轉(zhuǎn)變成U。
第2步，把帶標(biāo)簽1的隨機(jī)引物加入，進(jìn)行第一次的復(fù)制。得到第1條的復(fù)制鏈。
第3步，消化掉過量的引物。
第4步，加入帶末端終止堿基、并帶標(biāo)簽2的隨機(jī)引物。這個(gè)引物的作用是讓第1復(fù)制鏈延伸，并且加上標(biāo)簽2。
第5步，加入建庫的PCR引物，進(jìn)行PCR。通過PCR，把Index序列和成簇引物序列加入到鏈的兩側(cè)。得到真正的文庫。
這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是，把亞硫酸氫鹽處理的過程，放在了建庫之前。這樣建成的庫的豐富程度會比較高。但缺點(diǎn)就是要做較多的PCR循環(huán)，那么有了比較多的PCR循環(huán)之后，PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增均一性是不太好的。也就是說PCR bias會比較大。
因?yàn)榧谆膸熘薪?jīng)過亞硫酸氫鹽處理，絕大多數(shù)的C都變成了T。所以，這個(gè)文庫中是嚴(yán)重地缺少C堿基的，也就是四種堿基的比例是嚴(yán)重不平衡的。這樣在用HiSeq 2000或2500測序儀來測甲基化文庫的過程當(dāng)中，文庫測序得到的數(shù)據(jù)質(zhì)理就較差。并且經(jīng)過PF過濾得到的有效的數(shù)據(jù)產(chǎn)量也會較低。為了彌補(bǔ)甲基化文庫的堿基不平衡性，一般情況下，在上機(jī)過程當(dāng)中，是摻入大比例的基因組文庫，或者PhiX文庫，來補(bǔ)充比較多的C堿基，一般會摻30%的PhiX文庫、或者基因組文庫。在摻入30%的PhiX文庫的條件下，一條HiSeq 2000 V3 PE100的Lane，大概可以得到20G 左右的甲基化文庫數(shù)據(jù)。也就是說，在HiSeq 2000或者2500平臺上，甲基化文庫的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量，一直都不是很高。質(zhì)量也比較低。

2021-03-30 用于基因工程的工具酶

一,限制性內(nèi)切酶(Endonucleosase)
(一)限制性內(nèi)切酶(Endonucleosase)的發(fā)現(xiàn)與分類
1) 50年代初發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來 DNA 片段在某些專一位點(diǎn)上切斷,從而保證其不為外來噬菌體所感染,而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護(hù),這種現(xiàn)象叫做限制-修飾,它們由三個(gè)基因位點(diǎn)所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人們搞清了細(xì)菌的限制與修飾分子機(jī)理:
hsd R---限制性內(nèi)切酶
hsd M---限制性甲基化酶
hsd S---控制兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá)
1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個(gè)類內(nèi)切酶,Hind II和Hind III,為基因工程技術(shù)的誕生奠定了基礎(chǔ).
截止到目前為止,已經(jīng)分離出400余種II類酶,搞清識別位點(diǎn)的有300種,商品化的約有一百種,而實(shí)驗(yàn)室常用的有二十種 .
2)限制性核酸內(nèi)切酶可分為三大類:
I類 能識別專一的 核苷酸 順序,并在識別點(diǎn)附近切割雙鏈,但切割序列沒有專一性.
II類 識別位點(diǎn)(回文序列)嚴(yán)格專一,并在識別位點(diǎn)內(nèi)將雙鏈切斷
III類 識別位點(diǎn)嚴(yán)格專一(不是回文序列),但切點(diǎn)不專一,往往不在識別位點(diǎn)內(nèi)部.
因此在基因工程中具有實(shí)用價(jià)值的是II類限制性內(nèi)切酶.
(二)II類限制性內(nèi)切酶的命名及特性
命名原則:取屬名的第一個(gè)字母大寫,取種名的前兩個(gè)字母小寫,構(gòu)成基本名稱.該種中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序編號I, II, III等.如存在變種和品系,取變種或品系的一個(gè)字母.若酶存在于質(zhì)粒上,則需大寫字母表示非染色體遺傳因子.
如,HindIII從Haemophilus Influenzue d株中分離的第三個(gè)酶.EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗藥性R質(zhì)粒上.
(三)II類限制性內(nèi)切酶的底物識別順序及切割位點(diǎn)
絕大多數(shù)的II類限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的識別順序長度為4,5,6堿基對,這些堿基對的順序呈回文結(jié)構(gòu)(Palindromic),而且切點(diǎn)就在其內(nèi)部,如EcoRI 5'-GAATTC-3' .
DNA被限制性內(nèi)切酶切開之后,呈現(xiàn)兩種斷口:
鈍端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等
粘端(粘性末端)如:EcoR I等
圖2-1 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端
(四)識別位點(diǎn)在DNA分子中的頻率
對于特定的限制性酶在DNA分子中的識別位點(diǎn)數(shù)目是可以計(jì)算的,四堿基的酶平均大約每256個(gè)核苷酸(44)有一個(gè)識別位點(diǎn),而六堿基的酶大約4096(46)個(gè)核苷酸有一個(gè)識別序列,計(jì)算是在假定核苷酸隨機(jī)排列的情況下進(jìn)行的.實(shí)踐中這種方法不完全正確,如λ DNA長49kb,對于六堿基的酶應(yīng)該有12個(gè)切割位點(diǎn),實(shí)際上要少一些,如Bgl II只有6個(gè),BamHI只有5個(gè),而SalI只有2個(gè).
二,甲基化酶
在專一位點(diǎn)上甲基化,與限制性內(nèi)切酶相對應(yīng).
(一)大腸桿菌中的甲基化酶
dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,這樣可使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內(nèi)切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)則不會因?yàn)镹6A的甲基化而失去活性,因?yàn)檫@兩種酶對底物的特異性不同.
dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影響的限制性內(nèi)切酶是EcoR II.
(二) 甲基化酶在基因工程中用途
許多II類限制性內(nèi)切酶,都存在著相對的甲基化酶,它們可修飾限制酶識別順序中的第三位腺嘌呤上,封閉酶切位點(diǎn),從而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到EcoRI識別順序中的第三位腺嘌呤上,從而使DNA免受EcoRI的切割.
三,T4-DNA連接酶(T4-DNA Ligase)
來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌,連接修復(fù)3'端羥基和5'端磷酸基因,脫水形成3'-5'磷酸二酯鍵
連接雙鏈DNA上的單鏈缺口(Nick),因此亦可連接限制內(nèi)切酶所產(chǎn)生的粘性末端
連接RNA模板上的DNA鏈缺口
連接平頭雙鏈DNA速度很慢,在高濃度的底物和酶的作用下方可進(jìn)行,這屬于分子之間的連接.
四,核酸酶
作用: 降解磷酸二酯鍵
分為:外切酶 內(nèi)切酶
(一) Bal 31(來自于細(xì)菌Alteromonas espejiana) 單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性,雙鏈特異的內(nèi)切酶活性.依賴于Ca2+
用途:
構(gòu)建限制酶圖譜
產(chǎn)生末端缺失突變
DNA超螺旋線性化
(二)E. coli外切酶III
只降解DNA分子的一條鏈,產(chǎn)生單鏈的DNA分子.
(三)S1核酸酶(來源于米曲霉菌)
特性:
1. 降解單鏈DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度
2. 降解發(fā)生的方式為內(nèi)切和外切
3. 酶切活性需4.0-4.5pH環(huán)境,Zn2+激活
4. 酶量過大時(shí)會降解雙鏈核酸,因?yàn)殡p鏈降解活性比單鏈低75000倍
(四) DNase I: 來自于牛胰腺, 既可以降解單鏈也可以降解雙鏈,沒有特異性,產(chǎn)生單核苷酸或短鏈
五,聚合酶
(一)DNA聚合酶I
5'-3'聚合酶活性
3'-5'外切酶活性
5'-3'外切酶活性
核酸內(nèi)切酶活性
可以被枯草桿菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子.
(二) Klenow酶
該酶無5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用該酶:
修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成的5'突出的粘性末端
標(biāo)記DNA探針
催化cDNA第二條鏈的合成
末端終止法測序
圖2-4 Klenow 酶的作用方式
(三) T4 DNA聚合酶
與Klenow酶相似,外切酶活性更高.體外誘變反應(yīng)中效率很高.
(四)T7 DNA聚合酶
測序酶
(五) Taq DNA聚合酶
耐高溫,主要用于 PCR 反應(yīng).
(六) 逆轉(zhuǎn)錄酶:將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒)
DNA聚合酶活性
RNase H活性
DNA內(nèi)切酶活性
核酸結(jié)合活性
M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Moloney鼠白血病病毒)
兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別
肽鏈的組成
禽酶2條肽鏈,具聚合酶和很強(qiáng)的RNase H活性
鼠酶1條,較弱的RNase H活性
反應(yīng)的最適溫度
禽酶42°C,二級結(jié)構(gòu)豐富RNA,禽酶效率高
反應(yīng)的最適pH值
禽酶pH 8.3
鼠酶pH 7.6
六,DNA修飾酶
有大量的修飾酶,主要的有以下幾種:
1) 堿性磷酸酯酶(來自于大腸桿菌或小牛腸道)可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基團(tuán).
2) polynucleotide kinase: 來自于T4侵染的大腸桿菌,在5'端增加磷酸基團(tuán).
3) 末端脫氧核苷酸 轉(zhuǎn)移酶 (terminal deoxynucleotidyl tansferase) 來自于小牛胸腺 組織 ,在DNA分子的3'端增加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸.
4) Topoisomerase改變共價(jià)閉合雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)
第二節(jié) DNA的切割反應(yīng)
一,緩沖系統(tǒng)的組成
II類酶的酶活條件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM
根據(jù)不同酶對鹽離子要求不同,可將緩沖液分為以下三種情況:
高鹽:100-150mM
中鹽:50-100mM
低鹽:0-50mM
二,酶切操作
DNA量的確定,加入酶量的確定,發(fā)應(yīng)體積的確定(20μl),反應(yīng)時(shí)間的確定,1-1.5hr,一般為37℃,但也有例外,如Taq I在65°C時(shí)活性最高.
單位限制性內(nèi)切酶定義為:在最佳緩沖系統(tǒng)和20μl體積中反應(yīng)1小時(shí),完全水解1μgDNA所需的酶量.
三,酶切結(jié)果分析
(一) 酶切片段的檢測
1) 通過凝膠電泳分離,根據(jù)分子量分離.根據(jù)凝膠的濃度可以分離不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子.
2) DNA分子的檢測 a. 染色EB,DNA分子小于25ng,很難檢測到
b. 放射性自顯影, 可以監(jiān)測少到2ng DNA分子.
(二)估計(jì)DNA分子的大小
根據(jù)DNA分子的遷移率,可以用公式計(jì)算出分子量D=a-b(logM)
D是移動的距離,M是分子量,a, b是恒量但隨著電泳條件的改變而改變.
也可以根據(jù)已知大小的片段進(jìn)行比較,誤差約在5%左右.
四,多酶聯(lián)合酶解
對于對濃度要求相同的酶,原則上可以同時(shí)酶解;
對于對濃度要求不同的酶,可以:
1. 低鹽濃度的酶先切,后補(bǔ)加NaCL
2. 一種酶切后,換緩沖液,加5mM NaAc 0.1體積,2體積乙醇,冰浴5min,4℃離心10min, 干燥
五,定位酶切位點(diǎn)
建立酶切圖譜需要一系列的酶.
首先確定每一種酶切后產(chǎn)生的分子量和片段的數(shù)目;
然后進(jìn)行雙酶切;
比較酶切和雙酶切的結(jié)果,繪制酶切圖譜;
含糊的位點(diǎn)可以通過部分酶切解決,可以短時(shí)間的酶切或者在4°C條件下進(jìn)行.
六, 限制性內(nèi)切酶的star活性
在PH不合適,或甘油濃度過高≥10%時(shí),限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)會出現(xiàn)非專一性,因此應(yīng)確保酶的體積為總體積的十分之一以下.
第三節(jié) DNA片段的連接
重組DNA分子構(gòu)建的最后一步是連接,通過連接酶完成.相對而言,鈍端的連接效率較低,因此一般提高DNA濃度的方法增加接觸的機(jī)會.而粘性末端的連接效率較高,因?yàn)閮蓚€(gè)粘性末端可以通過氫鍵堿基互補(bǔ)配對.這種暫時(shí)的,堿基配對結(jié)構(gòu)可以提高連接的效率.在分子克隆的連接方式主要有以下幾種:
一,連接方式
(一)相同粘性末端的連接
來源:
相同的酶
同尾酶
問題:
極性有兩種可能
同尾酶連接后,不能用任何一種酶酶切.稱為"焊死".
(二)平頭末端的連接
粘性末端--分子內(nèi)部連接,平頭末端--分子間的連接.
提高連接效率的方法:
加大酶用量(10倍)
加大平頭末端底物的濃度
加入10%PEG(8000),促進(jìn)分子間的有效作用
加入單價(jià)陽離子, 150-200mM NaCl
提高反應(yīng)溫度
平頭連接同樣存在兩種極性
(三)不同粘性末端的連接
突出5'末端
Klenow補(bǔ)平,或S1核酸酶切平,然后平頭連接
突出3'末端
T4-DNApol切平,然后平頭連接
突出末端不同
Klenow補(bǔ)平,或S1核酸酶切平
連接后,可能恢復(fù)限制性位點(diǎn),甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn).XbaI與HindIII( XbaI恢復(fù)), XbaI與EcoRI(均保留),BamHI與Bgl II(產(chǎn)生ClaI位點(diǎn))
(四)人工粘性末端的連接
5'突出的末端
外源片段先用Klenow補(bǔ)平;然后用TdT補(bǔ)加polyC;載體片段也用Klenow補(bǔ)平,加polyG,退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化.目的是:不使酶切位點(diǎn)遭受破壞.
3'突出的末端
外源片段先用TdT加polyG;載體片段加polyC;然后退火;再用Klenow補(bǔ)齊;連接
平頭末端
可直接用TdT補(bǔ)加末端,但以加polyA/T為佳.這樣稍微 加熱 ,AT區(qū)就會出現(xiàn)單鏈區(qū)域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段
(五)粘端與平端的連接
linker : 人工合成的,含有限制性內(nèi)切酶識別序列的,短的雙鏈DNA片段.
– 連接的效率較高
– 酶切時(shí)可能破壞DNA分子的完整.
adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸.
(六)粘性末端的更換
在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口
– BamHI酶切片段用Klenow補(bǔ)平,或用S1酶切平;連接一段linker或Adaptor,使之產(chǎn)生EcoRI粘性末端.這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口 .
– 由AluI更換EcoRI:AluI切開,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切開,Klenow補(bǔ)平,連接,原來含有AluI的片段變成含有EcoRI
二,重組率
重組率:連接反應(yīng)結(jié)束后,含有外源DNA片段的重組分子數(shù)與加入的載體分子數(shù)之比.較為理想的重組率為25-75%
提高重組率的方法:
連接反應(yīng)條件 外源片段:載體=2:1-10:1(分子數(shù)),增加碰撞機(jī)會,減少自身環(huán)化.
載體除磷 (磷酸酯酶5'除磷).
TdT在3'端增加人工粘性末端,防止載體自我環(huán)化
(責(zé)任編輯：大漢昆侖王)