pcr實(shí)驗(yàn)步驟

pcr實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1.初始化步驟。這僅對(duì)熱啟動(dòng)PCR必不可少。此步驟將溶液加熱至94-98°C，以激活DNA聚合酶。該步驟的時(shí)間取決于所使用的聚合酶。

2.變性步驟。DNA是雙鏈分子，DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應(yīng)混合物加熱至94-98°C并保持20-30秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈DNA分子。此時(shí)進(jìn)入PCR循環(huán)。

3.退火步驟。變性后，反應(yīng)混合物中的DNA模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降低到50-65℃時(shí)，引物會(huì)與模板序列匹配，互補(bǔ)堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約20-40秒以完全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始DNA組裝。

4.伸長(zhǎng)步驟。在此步驟中，DNA聚合酶開始合成DNA，因此溫度應(yīng)為DNA聚合酶的最適溫度。一般選擇72°C，但有些酶在68°C時(shí)效果更好。

這一步與體內(nèi)DNA復(fù)制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補(bǔ)，最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時(shí)間取決于目標(biāo)DNA片段的長(zhǎng)度和DNA聚合酶的能力。一般來(lái)說(shuō)，DNA聚合酶每60秒產(chǎn)生一千個(gè)堿基。

5.2~4步稱為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次，目標(biāo)片段量翻倍。一個(gè)PCR過(guò)程使用30-35個(gè)循環(huán)。在PCR循環(huán)的早期，PCR產(chǎn)物以指數(shù)速率積累，而在PCR循環(huán)的后期，隨著dNTPs、引物的減少和DNA聚合酶在變性溫度下的失活，反應(yīng)減慢，PCR速率逐漸下降。

6.最終伸長(zhǎng)率。30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。

7.貯存。最終產(chǎn)品可以在PCR機(jī)器中維持溫度在4-10°C。

高通量測(cè)序的步驟？

當(dāng)然，首先地提取出您想要測(cè)序的東西，比如RNA、DNA 。再就是建庫(kù)-測(cè)序-分析。建庫(kù)需要將序列片段化、加接頭、PCR。不同的業(yè)務(wù)有細(xì)微的差別，比如RNA要先反轉(zhuǎn)錄成cDNA等等。然后就是上機(jī)測(cè)序了！最后就是數(shù)據(jù)分析了。數(shù)據(jù)分析分為流程分析（基本分析）和個(gè)性分析（根據(jù)老師課題分析）。這些以后呢，就是利用數(shù)據(jù)寫進(jìn)文章準(zhǔn)備發(fā)文章吧！

PCR的完整操作步驟是什么？

首先在PCR儀中設(shè)定程序：一般是94度變性5min，之后“94度變性、退火（不同引物溫度不同）、72度”延伸共30-35個(gè)循環(huán)，再72度延伸10min，最后hold16度即可。反應(yīng)體系一般有20微升或50微升，由上下游引物、buffer、dNTP、模板、Taq酶和水等組成，配好后放入PCR儀中按設(shè)定程序進(jìn)行即可。

pcr的技術(shù)的主要步驟及pcr引物設(shè)計(jì)的一般原則有哪些

PCR的技術(shù)的主要步驟及PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則分述如下：

PCR的技術(shù)的主要步驟：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。

2、引物設(shè)計(jì)的基本原則

1、引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

4、兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。

5、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

6、引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

擴(kuò)展資料

PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的 天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

PCR是一種體外DNA 擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。

在環(huán)境檢測(cè)中，靶核酸序列往往存在于—個(gè)復(fù)雜的混合物如細(xì)胞提取液中，且含量很低，對(duì)于探測(cè)這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個(gè)基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大幾個(gè)數(shù)量級(jí)，再用探針雜交探測(cè)對(duì)被擴(kuò)增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。PCR技術(shù)常與其他技術(shù)結(jié)合起來(lái)使用， 如RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常見的定性PCR技術(shù)，它采用普通PCR儀來(lái)對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。第二代PCR就是熒光定量PCR技術(shù)（Real-Time PCR，qPCR），它通過(guò)在反應(yīng)體系中加入能指示反應(yīng)進(jìn)程的熒光試劑來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，借助熒光曲線的Cq值來(lái)定量起始靶基因的濃度。

第三代PCR技術(shù)--數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一種全新的對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)和定量的方法。它采用直接計(jì)數(shù)目標(biāo)分子而不再依賴任何校準(zhǔn)物或外標(biāo)，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目。

PCR芯片技術(shù)PCR儀器發(fā)展的趨勢(shì)之一變得更加微型化，PCR芯片就是在這種趨勢(shì)下誕生的。PCR芯片就是在微型的載體上進(jìn)行PCR反應(yīng)，是微型化的PCR儀。芯片PCR不僅節(jié)省了大量反應(yīng)試劑因此降低了實(shí)驗(yàn)成本，還有助于提高反應(yīng)速度。

參考資料：百度百科-PCR技術(shù)

PCR實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟是什么？

實(shí)驗(yàn)方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個(gè)步驟，通過(guò)將這一套過(guò)程不斷循環(huán)，使DNA得以成百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。

擴(kuò)展資料

PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國(guó)PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。

這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。

它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來(lái)的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單。

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

參考資料來(lái)源：百度百科-pcr擴(kuò)增