哪位可以分享轉(zhuǎn)染raw 264.7細(xì)胞經(jīng)驗(yàn)？

為了轉(zhuǎn)染raw 264.7小鼠巨噬單核細(xì)胞我們實(shí)驗(yàn)室嘗試了lipo3000、,FuGENE 6、FuGENE HD、Effectene等其它轉(zhuǎn)染試劑，對(duì)于我們8000bp的質(zhì)粒DNA基本轉(zhuǎn)染后都沒(méi)有熒光信號(hào)；師兄在中山大學(xué)的同學(xué)給我們推薦了他們實(shí)驗(yàn)室用Zeta Life Advanced DNA RNA貨號(hào)AD600050轉(zhuǎn)染raw 264.7細(xì)胞經(jīng)驗(yàn)分享。

按照中山大學(xué)師兄給出的方法并結(jié)合我實(shí)驗(yàn)室情況我把自己在6孔板轉(zhuǎn)染raw 264.7細(xì)胞的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)整理如下，希望對(duì)你轉(zhuǎn)染raw 264.7細(xì)胞有一定的幫助，下面是我首次用轉(zhuǎn)染raw 264.7細(xì)胞的熒光和細(xì)胞明場(chǎng)圖片，后期進(jìn)一步優(yōu)化后的新圖片我也會(huì)隨后呈上：

一、質(zhì)粒DNA準(zhǔn)備

1、質(zhì)粒DNA濃度700ng/ul（注意：①溶解于無(wú)菌雙蒸水或超純水；②無(wú)內(nèi)毒素），我用QIAGEN試劑盒除去的內(nèi)毒素

二、操作流程

1、先將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞匯合度在70%左右，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2、復(fù)合物制備：將質(zhì)粒DNA與Zeta Life Advanced Transfection Reagent AD600050轉(zhuǎn)染試劑按照1:1（12ug:12ul）關(guān)系直接混合，用移液器吹吸10-15次混勻，室溫靜止10-15分鐘。

3、將復(fù)合物加入完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板，并輕輕混勻，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（不建議把復(fù)合物加入到無(wú)血清的培養(yǎng)基里面，我后期會(huì)進(jìn)一步摸索此條件）。

4、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常換液。

5、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

三、注意事項(xiàng)：

1本轉(zhuǎn)染方法不適用在下面轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染如：lipo3000、,FuGENE 6、FuGENE HD、Effectene等轉(zhuǎn)染試劑；

2細(xì)胞培養(yǎng)基：Zeta Life公司 z7181-500胎牛血清，Gibco公司DMEM;

有哪位做過(guò)RAW264.7巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)染嗎

請(qǐng)先把細(xì)胞養(yǎng)好，我實(shí)驗(yàn)室用Advanced Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑AD60015做了24孔板轉(zhuǎn)染RAW264.7小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染體系大概總結(jié)如下 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA：pcDNA3.1-GFP 質(zhì)粒DNA大?。?000bp 轉(zhuǎn)染完全培養(yǎng)基用量：500ul 轉(zhuǎn)染試劑用量：2.5ul 轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度：80%

關(guān)于RAW264.7巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染的問(wèn)題

跟您細(xì)胞的狀態(tài)有關(guān)，RAW246.7是單核-巨噬細(xì)胞，如果培養(yǎng)條件不好，就容易被誘導(dǎo)分化，這也直接影響轉(zhuǎn)染效率，我們實(shí)驗(yàn)室一般都會(huì)選擇RFect-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，本身RAW264.7巨噬細(xì)胞也是比較皮實(shí)的,比普通貼壁細(xì)胞略微難度要大一點(diǎn)。

請(qǐng)問(wèn)各位高手用什么轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)RAW264.7轉(zhuǎn)染效率比較高??？

請(qǐng)先把細(xì)胞養(yǎng)好，我實(shí)驗(yàn)室用Advanced Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑AD60015做了24孔板轉(zhuǎn)染RAW264.7小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染體系大概總結(jié)如下 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA：pcDNA3.1-GFP 質(zhì)粒DNA大?。?000bp 轉(zhuǎn)染完全培養(yǎng)基用量：500ul 轉(zhuǎn)染試劑用量：2.5ul 轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度：80%

用那種方法可以提高RAW 264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率？

在6孔板中用Zeta Life Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑高效率轉(zhuǎn)染RAW 264.7細(xì)胞方法總結(jié)。

實(shí)驗(yàn)方案如下：

一、質(zhì)粒DNA準(zhǔn)備

1、質(zhì)粒DNA濃度700ng/ul（注意：①溶解于無(wú)菌雙蒸水或超純水；②無(wú)內(nèi)毒素），

二、操作流程

1、先將細(xì)胞接種到6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞匯合度在70%左右，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2、復(fù)合物制備：將質(zhì)粒DNA與Zeta Life Advanced DNA RNA AD600150轉(zhuǎn)染試劑按照1:1（12ug:12ul）關(guān)系直接混合，用移液器吹吸10-15次混勻，室溫靜止10-15分鐘。

3、將復(fù)合物加入完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板，并輕輕混勻，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（不建議把復(fù)合物加入到無(wú)血清的培養(yǎng)基里面，后期會(huì)進(jìn)一步摸索此條件）。

4、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常換液。

5、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

下圖是轉(zhuǎn)染raw 264.7細(xì)胞的熒光和明場(chǎng)圖片

三、RAW 264.7細(xì)胞簡(jiǎn)述：

RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞. 此細(xì)胞株源自雄性Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤。 sIg-, Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原陰性。此細(xì)胞株不分泌可檢測(cè)到的病毒顆粒，XC斑點(diǎn)形成試驗(yàn)陰性。 可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖。 可以抗體依賴(lài)性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細(xì)胞。