PCR反應(yīng)中使用的Taq聚合酶的有什么特點(diǎn)

Taq聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶, Taq聚合酶的缺點(diǎn)之一為催化DNA合成時(shí)的相對(duì)低保真性。 它缺乏3’→5’核酸外切酶的即時(shí)校正機(jī)制，出錯(cuò)率為1/9000。 不過PCR的反應(yīng)都是在冰上進(jìn)行的， Taq聚合酶也是比較容易降解的，是最后一步加入的。 請(qǐng)采納

Taq DNA聚合酶問題

大部分耐熱性DNA聚合酶在PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個(gè)“A”的特性。這一步往往在72℃ 10分鐘過程產(chǎn)生，Taq酶可以在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A，因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。

taqdna聚合酶每分鐘可延伸多長(zhǎng)的片段

常見的Taq酶按照說明書每分鐘可擴(kuò)增1000-2000bp，實(shí)踐表明擴(kuò)增速度比這個(gè)還快些。

PCR反應(yīng)中使用的Taq聚合酶的有什么特點(diǎn)

Taq聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶, Taq聚合酶的缺點(diǎn)之一為催化DNA合成時(shí)的相對(duì)低保真性。 它缺乏3’→5’核酸外切酶的即時(shí)校正機(jī)制，出錯(cuò)率為1/9000。 不過PCR的反應(yīng)都是在冰上進(jìn)行的， Taq聚合酶也是比較容易降解的，是最后一步加入的。 請(qǐng)采納

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)

（Initial denaturation）
模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。 循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間
變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 （Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。
退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。 引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略
延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。 （70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。 PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對(duì)原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。