酶活性測(cè)定的原理是什么

酶活性測(cè)定的原理：

1. 超氧物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）

   活性的測(cè)定 SOD采用氮藍(lán)四唑（nitro-bluetetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反應(yīng)步驟為：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反應(yīng)液50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮藍(lán)四唑,100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保溫2分鐘后加入100μl核黃素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸緩沖液中含80.2μmol/L 核黃素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反應(yīng)20min。然后迅速測(cè)定A560。以不照光的管做空白。用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定時(shí)按比例調(diào)整為總反應(yīng)體積為400μL。酶活性按以下公式計(jì)算：以抑制NBT光化還原的50％為一個(gè)SOD活性單位，結(jié)果以U/mg蛋白表示。以加緩沖液代替酶液的作為對(duì)照。

   SOD總活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml）；Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量（ml）；W為樣品鮮重（g）或蛋白質(zhì)含量（mg）。

2. 過氧化氫酶（Catalase，CAT）

   活性測(cè)定 CAT 活性參照Aebi(1984)[7]的方法進(jìn)行測(cè)定。用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定時(shí)按比例調(diào)整為總反應(yīng)體積為400μL 。400 μL反應(yīng)液含50mmol/L的PBS(pH7.0)，30mmol/L的H2O2和50μL粗酶液。反應(yīng)從加入過氧化氫開始計(jì)時(shí)，連續(xù)測(cè)定在240nm吸光度的降低值。酶活性定義為：一個(gè)過氧化氫酶單位相當(dāng)于在規(guī)定條件下于溫度25℃，pH7.0條件下1分鐘分解1μmol過氧化氫所需酶量，結(jié)果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。

3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）

   活性的測(cè)定 PPO活性測(cè)定采用鄰苯二酚法（Aquino-Bola?os和Mercado-Silva，2004）。用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定時(shí)按比例調(diào)整為總反應(yīng)體積為400μL。350μL反應(yīng)液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，內(nèi)含100μmol/L鄰苯二酚）中加入50μL的粗酶液，平衡1分鐘后連續(xù)測(cè)定398nm吸光度的變化。以1分鐘內(nèi)398nm吸光度上升0.01為一個(gè)酶活性單位，結(jié)果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。

4. 過氧化物酶（Peroxidase，POD）

   活性測(cè)定POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法（Lurie等，1997)。用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定時(shí)按比例調(diào)整為總反應(yīng)體積為400μL。反應(yīng)體系為30μL粗酶液，290μL0.3%愈創(chuàng)木酚（用50mmol/L的PBS配制，pH6.4）和 80μL0.3%H2O2（用50mmol/L的PBS配制，pH6.4）。反應(yīng)在加入H2O2 后開始準(zhǔn)確記時(shí)。連續(xù)吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分鐘上升0.01為一個(gè)單位，結(jié)果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。

酶特性的檢驗(yàn)原理

酶活性測(cè)定法是利用酶能專一而高效地催化化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)，通過測(cè)定酶促反應(yīng)速度來檢知體液等生物樣品中某種酶的含量和活性的分析技術(shù)。

酶活力的測(cè)定可采用兩種方式：

其一是測(cè)定完成一定量反應(yīng)所需的時(shí)間，其二是測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)的酶催化的化學(xué)反應(yīng)量。

終點(diǎn)法

該方式是在特定條件下，將樣品中要檢知的酶作用一定量的底物，然后根據(jù)反應(yīng)進(jìn)行到某一程度(即達(dá)到某一指標(biāo))所需要的時(shí)間長(zhǎng)短來估計(jì)酶的活力。

其一個(gè)發(fā)展是采用檢測(cè)器對(duì)反應(yīng)進(jìn)行連續(xù)跟蹤，并在反應(yīng)達(dá)到某一程度時(shí)，精確地自動(dòng)記錄所需要的時(shí)間，這就是酶分析自動(dòng)化中的固定濃度法；另一個(gè)發(fā)展是作成簡(jiǎn)便的酶檢測(cè)紙片。

動(dòng)力學(xué)法

該方式測(cè)定原理是：在一定條件下，酶促反應(yīng)速度和酶濃度成正比，因此測(cè)得反應(yīng)速度就需要求得酶濃度。待測(cè)的酶濃度是影響反應(yīng)速度的唯一因素，其他因素都應(yīng)處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平，為此應(yīng)選擇適宜的底物濃度、緩沖體系、溫度，并向反應(yīng)系統(tǒng)中添加必要的輔助因子。

雙乙酰檢測(cè)酶活力的原理

原理:酶活力測(cè)定的原理是利用了沒能專一高效的催化化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)，通過鑒定沒反應(yīng)，速度來判斷體驗(yàn)等生物標(biāo)本檢測(cè)。 酶活力鑒定屬于一種某種物理方法測(cè)定化合物，通過檢測(cè)以后，能夠查看出酶反應(yīng)的過程中變化的程度來測(cè)定反應(yīng)情況，然后進(jìn)行酶活力的分析，能夠判斷身體是否出現(xiàn)異常變化，這種酶活性鑒定主要用于肝膽科進(jìn)行檢測(cè)身體的酶活量，來判斷轉(zhuǎn)氨酶高低的情況。

2.為什么臨床生化檢測(cè)中采用酶活檢測(cè)來反映酶含量?

臨床生化檢測(cè)中采用酶活檢測(cè)來反映酶含量的原因主要包括以下幾方面： 1. 酶活性可以反映酶的活性狀態(tài)：酶是一種能夠促進(jìn)生物化學(xué)反應(yīng)的催化劑，對(duì)生物體內(nèi)代謝有決定性影響。酶的活性取決于其結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)環(huán)境，如溫度、pH、離子強(qiáng)度等。因此通過檢測(cè)酶活性可以了解酶在生理狀態(tài)下的活性程度。 2. 酶活性可以反映酶的特異性：酶在催化反應(yīng)時(shí)，與特定的底物結(jié)合，從而使反應(yīng)快速進(jìn)行。不同酶對(duì)應(yīng)的底物一般是特異性的，因此檢測(cè)酶活性也可以為其所對(duì)應(yīng)的底物提供依據(jù)，并反映其在代謝通路中的位置。 3. 酶活性可以反映酶的數(shù)量：酶活性與酶的數(shù)量之間存在一定的相關(guān)性。在正常情況下，酶活性與酶含量成正比。因此通過檢測(cè)酶活性也

為什么要測(cè)酶活力

酶活力（enzyme activity）也稱為酶活性， 測(cè)量酶活力的原因：測(cè)定酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。 酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測(cè)定酶活力實(shí)際就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在一般的酶促反應(yīng)體系中，底物往往是過量的，測(cè)定初速度時(shí)，底物減少量占總量的極少部分，不易準(zhǔn)確檢測(cè)，而產(chǎn)物則是從無(wú)到有，只要測(cè)定方法靈敏，就可準(zhǔn)確測(cè)定。因此一般以測(cè)定產(chǎn)物的增量來表示酶促反應(yīng)速度較為合適.