12000轉(zhuǎn)離心5分鐘的目的
- 教育綜合
- 2023-09-18 17:44:22
有關(guān)實(shí)驗(yàn)“DNA的提取及檢測”的問題
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作： 1 所用離心管、槍頭要洗凈、烘干（最好滅菌）。 2 試劑配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0): 稱取Tris-Base 121g, 加入約800 ml 水在磁力攪拌器上攪拌，使其充分溶解后加入濃鹽酸調(diào)整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 滅菌后于室溫保存。 0.5 M EDTA (pH 8.0): 稱取EDTA-Na2鹽 187 g 加入約 800 ml水，在磁力攪拌器上邊攪拌邊加入固體NaOH，當(dāng)EDTA和NaOH均完全溶解，溶液變清時(shí)其pH值剛好達(dá)到8.0左右，再用pH試紙略加調(diào)整即可, 滅菌后于室溫保存。 5.0 M NaCl: 稱取NaCl 300質(zhì)粒DNA的小量制備 注意哪些操作 為什么
質(zhì)粒DNA的小量制備注意事項(xiàng)：
如有必要，在酶切反應(yīng)液中加人1 μl10mg/mlRNA酶溶液（不含DNA酶）以去除污染的RNA。
在使用前,在溶液Ⅳ（洗滌液）加入40ml無水乙醇,然后在瓶蓋上作好記號。
溶液Ⅱ（lysis buffer）在溫度較低時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生沉淀,需先用水浴加熱溶解，混勻后再使用.溶液Ⅱ易被空氣中的CO2酸化，用完后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋。
最后加水溶解質(zhì)粒時(shí)，可先將水加熱,提高溶解度。
質(zhì)粒DNA的小量制備的步驟：
細(xì)菌的收獲：將1.5ml菌液倒入微量離心管中，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液。上清要?jiǎng)?wù)必吸取干凈，否則會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。必要時(shí)可以離心2次。
將細(xì)菌沉淀重懸于150μl用冰預(yù)冷的溶液I中，加入1/50體積RNAseA貯存液，劇烈振蕩，使之完全分散。
溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)
不含dna酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分裝貯存
注：（1）溶液I高壓蒸氣滅菌后，貯存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于儲存；但提取大于15kb的質(zhì)粒，應(yīng)將細(xì)菌懸于等滲蔗糖溶液中，并用溶菌酶處理；（3）務(wù)必使細(xì)菌沉淀完全分散，以利于堿液作用充分；（4）震蕩時(shí)可以在離心管中加入牙簽或槍頭，提高效率；（5）配制RNaseA貯存液時(shí)，煮沸時(shí)間不宜過長或過短；（6）溶液I每2個(gè)月重新配制1次。加200μl溶液Ⅱ，顛倒混勻。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS
注：（1）若菌體裂解得充分，則溶液會(huì)變得很粘稠；（2）不要?jiǎng)×艺鹗?，否則會(huì)混入基因組DNA；（3）每2個(gè)月重新配制1次。加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，輕微震蕩混勻
溶液Ⅲ：5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml
注：（1）所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）盡量不要有大的塊狀沉淀，以利于下步離心；（3）每1個(gè)月重新配制1次，并分裝貯存于小口瓶中。12000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
加入1/2體積的Tris飽和酚、1/2體積的氯仿-異戊醇(24:1)混合液，劇烈震蕩混勻。
12000g離心5分種，將上層液體轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
注：為了保證不吸出下層液體，可以先離心30秒，然后將上層與少量下層液體吸至另一離心管，離心5分種，再轉(zhuǎn)移上層液體。切勿混入下層液體。加入60%體積的異丙醇，顛倒混勻后，室溫靜置5分鐘。12000g離心5~10分鐘，小心吸去上清液。
注：（1）沉淀即為質(zhì)粒DNA；（2）為確保質(zhì)粒完全沉淀，異丙醇的體積可以適當(dāng)加大至62~65%。0.8ml70%乙醇洗滌DNA沉淀后，小心地吸去上清。在空氣中靜置3~10分鐘，待沉淀干燥后，溶解于50μl高壓滅菌的水中。
注：為洗滌充分，可以洗2次。取1~2μl樣品測定紫外吸光度，對所得質(zhì)粒進(jìn)行定量并了解其純度，或取1~2μl樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳，估計(jì)其純度和得率。
