多肽合成的基本原理是什么？

多肽合成

多肽合成又叫肽鏈合成，是一個固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。合肥合生生物多肽的合成主要分為兩條途徑:化學(xué)合成多肽和生物合成多肽。

多肽合成的原理

多肽合成就是如何把各種氨基酸單位按照天然物的氨基酸排列順序和連接方式連接起來。由于氨基酸在中性條件下是以分子內(nèi)的兩性離子形式(H3+NCH(R)COO-)存在，因此，氨基酸之間直接縮合形成酰胺鍵的反應(yīng)在一般條件下是難于進行的。

氨基酸酯的反應(yīng)活性較高。在100℃下加熱或者室溫下長時間放置都能聚合生成肽酯，但反應(yīng)并沒有定向性，兩種氨基酸a1和a2的酯在聚合時將生成a1a2…、a1a1…、a2a1…等各種任意順序的混合物。

為了得到具有特定順序的合成多肽，采用任意聚合的方法是行不通的，合肥合生生物而只能采用逐步縮合的定向多肽合成方法。一般是如下式所示，即先將不需要反應(yīng)的氨基或羧基用適當(dāng)?shù)幕鶊F暫時保護起來，然后再進行連接反應(yīng)，以保證多肽合成的定向進行。

式中的X和Q分別為氨基和羧基的保護基，它不僅可以防止亂接副反應(yīng)的發(fā)生，還具有能消除氨基酸的兩性離子形式，并使之易溶于有機溶劑的作用。

Q在有的情況下也可以不是共價連接的基團，而是由有機強堿(如三乙胺)同氨基酸的羧基氫離子組成的有機陽離子。Y為一強的吸電子基團，它能使羧基活化，而有利于另一氨基酸的自由氨基，對其活化羧基的羧基碳原子進行親核進攻生成酰胺鍵。

由此所得的連接產(chǎn)物是N端和C端都帶有保護基的保護肽，要脫去保護基后才能得到自由的肽。如果肽鏈不是到此為止，而是還需要從N端或C端延長肽鏈的話，則可以先選擇性地脫去X或Q，然后再同新的N保護氨基酸(或肽)或C保護的氨基酸(或肽)進行第二次連接，并依次不斷重復(fù)下去，直到所需要的肽鏈長度為止。

對于長肽的多肽合成來說，一般有逐步增長和片段縮合兩種伸長肽鏈的方式，前者是由起始的氨基酸(或肽)開始。每連接一次，接長一個氨基酸，后者則是用N保護肽同C保護肽縮合來得到兩者長度相加的新的長肽鏈。

對于多肽合成中含有谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、半胱氨酸等等帶側(cè)鏈功能團的氨基酸的肽來說，為了避免由于側(cè)鏈功能團所帶來的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo基將側(cè)鏈基團暫時保護起來。

多肽合成方法分類

多肽的合成主要分為兩條途徑:化學(xué)合成多肽和生物合成多肽。

化學(xué)合成主要是以氨基酸與氨基酸之間縮合的形式來進行。在合成含有特定順序的多肽時，由于多肽合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體，多肽合成時應(yīng)將不需要反應(yīng)的基團暫時保護起來，方可進行成肽反應(yīng)，這樣保證了多肽合成目標(biāo)產(chǎn)物的定向性。多肽的化學(xué)合成又分為液相合成和固相合成。

多肽液相合成主要分為逐步合成和片段組合兩種策略。逐步合成簡潔迅速，可用于各種生物活性多肽片段的合成。片段組合法主要包括天然化學(xué)連接和施陶丁格連接。近年，多肽液相片段合成法發(fā)展迅速，在多肽和蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根據(jù)多肽片段的化學(xué)特定性或化學(xué)選擇性，多肽片段能夠自發(fā)進行連接，得到目標(biāo)多肽。因為多肽片段含有的氨基酸殘基相對較少，所以純度較高，且易于純化。

多肽的生物合成方法主要包括發(fā)酵法、酶解法，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，以DNA重組技術(shù)為主導(dǎo)的基因工程法也被應(yīng)用于多肽的合成。

多肽的固相合成

多肽的合成是氨基酸重復(fù)添加的過程，通常從C端向N端(氨基端)進行合成。多肽固相合成的原理是將目的肽的第一個氨基酸C端通過共價鍵與固相載體連接，再以該氨基酸N端為合成起點，經(jīng)過脫去氨基保護基和過量的已活化的第二個氨基酸進行反應(yīng)，接長肽鏈，重復(fù)操作，達到理想的合成肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，分離純化，獲得目標(biāo)多肽。

1、Boc多肽合成法

Boc方法是經(jīng)典的多肽固相合成法，以Boc作為氨基酸α-氨基的保護基，芐醇類作為側(cè)鏈保護基，Boc的脫除通常采用三氟乙酸(TFA)進行。多肽合成時將已用Boc保護好的N-α-氨基酸共價交聯(lián)到樹脂上，TFA切除Boc保護基，N端用弱堿中和。

肽鏈的延長通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)活化、偶聯(lián)進行，最終采用強酸氫氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)將合成的目標(biāo)多肽從樹脂上解離。在Boc多肽合成法中，為了便于下一步的多肽合成，反復(fù)用酸進行脫保護，一些副反應(yīng)被帶入實驗中，例如多肽容易從樹脂上切除下來，氨基酸側(cè)鏈在酸性條件不穩(wěn)定等。

2、Fmoc多肽合成法

Carpino和Han以Boc多肽合成法為基礎(chǔ)發(fā)展起來一種多肽固相合成的新方法——Fmoc多肽合成法。

Fmoc多肽合成法以Fmoc作為氨基酸α-氨基的保護基。其優(yōu)勢為在酸性條件下是穩(wěn)定的，不受TFA等試劑的影響，應(yīng)用溫和的堿處理可脫保護，所以側(cè)鏈可用易于酸脫除的Boc保護基進行保護。

肽段的最后切除可采用TFA/二氯甲烷(DCM)從樹脂上定量完成，避免了采用強酸。同時，與Boc法相比，F(xiàn)moc法反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，產(chǎn)率高，并且Fmoc基團本身具有特征性紫外吸收，易于監(jiān)測控制反應(yīng)的進行。Fmoc法在多肽固相合成領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛。

多肽液相分段合成

隨著多肽合成的發(fā)展，多肽液相分段合成(即多肽片段在溶液中依據(jù)其化學(xué)專一性或化學(xué)選擇性，自發(fā)連接成長肽的合成方法)在多肽合成領(lǐng)域中的作用越來越突出。其特點在于可以用于長肽的合成，并且純度高，易于純化。

多肽液相分段合成主要分為天然化學(xué)連接和施陶丁格連接。天然化學(xué)連接是多肽分段合成的基礎(chǔ)方法，局限在于所合成的多肽必須含半光氨酸(Cys)殘基，因而限定了天然化學(xué)連接方法的應(yīng)用范圍。天然化學(xué)連接方法的延伸包括化學(xué)區(qū)域選擇連接、可除去輔助基連接、光敏感輔助基連接。

施陶丁格連接方法是另一種基礎(chǔ)的片段連接方法，其為多肽片段連接途徑開拓了更廣闊的思路。正交化學(xué)連接方法是施陶丁格連接方法的延伸，通過簡化膦硫酯輔助基來提高片段間的縮合率。

其他多肽合成方法

1、氨基酸的羧內(nèi)酸酐法(NCA)

氨基酸的羧內(nèi)酸酐的氨基保護基也可活化羧基。

NCA的原理:在堿性條件下，氨基酸陰離子與NCA形成一個更穩(wěn)定的氨基甲酸酯類離子，在酸化時該離子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又與其他的NCA結(jié)合，反復(fù)進行。

NCA適用于短鏈肽片段的多肽合成，其周期短、操作簡單、成本低、得到產(chǎn)物分子量高，在目前多肽合成中所占比例較大，技術(shù)也較為通用。

2、組合化學(xué)法

20世紀(jì)80年代，以固相多肽合成為基礎(chǔ)提出了組合化學(xué)法，即氨基酸的構(gòu)建單元通過組合的方式進行連接，合成出含有大量化合物的化學(xué)庫，并從中篩選出具有某種理化性質(zhì)或藥理活性化合物的一套多肽合成策略和篩選方案。

組合化學(xué)法的多肽合成策略主要包括:混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫法、茶葉袋法等。組合化學(xué)法的最大優(yōu)點在于可同時合成多種化合物，并且能最大限度地篩選各種新化合物及其異構(gòu)體。

3、酶解法

酶解法是用生物酶降解植物蛋白質(zhì)和動物蛋白質(zhì)，獲得小分子多肽。酶解法因其多肽產(chǎn)量低、投資大、周期長、污染嚴(yán)重，未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。酶解法獲得的多肽能夠保留蛋白質(zhì)原有的營養(yǎng)價值，并且可以獲得比原蛋白質(zhì)更多的功能，更加綠色，更加健康。

4、基因工程法

基因工程法主要以DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)，通過合適的DNA模板來控制多肽的序列合成。有研究者通過基因工程法獲得了準(zhǔn)彈性蛋白-聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的活性多肽還有肽類抗生素、干擾素類、白介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子、人生長激素，血液中凝血因子、促紅細(xì)胞生成素，組織非蛋白纖溶酶原等。

基因工程法合成多肽具有表達定向性強，安全衛(wèi)生，原料來源廣泛和成本低等優(yōu)點，但因存在高效表達，不易分離，產(chǎn)率低的問題，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

5、發(fā)酵法

發(fā)酵法是從微生物代謝產(chǎn)物中獲得多肽的方法。雖然發(fā)酵法的成本低，但其應(yīng)用范圍較窄，因為現(xiàn)在微生物能夠獨立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和藍細(xì)菌肽。

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乙酰氯保護氨基的條件

氨基保護方法胺類化合物對氧化和取代等反應(yīng)都很敏感,為了使分子其它部位進行反應(yīng)時氨基保持不變，通常需要用易于脫去的基團對氨基進行保護。例如,在肽和蛋白質(zhì)的合成中常用氨基甲酸酯法保護氨基，而在生物堿及核苷酸的合成中用酰胺法保護含氮堿基?；瘜W(xué)家們在肽的合成領(lǐng)域內(nèi),對已知保護基的相對優(yōu)劣進行了比較并在繼續(xù)尋找更有效的新保護基。除了肽的合成外,這些保護基在其它方面也有很多重要應(yīng)用.下面介紹保護氨基的一些主要方法和基團。1 形成酰胺法將胺變成取代酰胺是一個簡便而應(yīng)用非常廣泛的氨基保護法。單?；阋员Ｗo一級胺的氨基，使其在氧化、烷基化等反應(yīng)中保持不變,但更完全的保護則是與二元酸形成的環(huán)狀雙酰化衍生物。常

多肽固相合成法的保護

要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護，反應(yīng)完成后再將保護基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護基，因為這樣不易發(fā)生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強的酸解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧羰基（BOC）保護，用TFA（三氟乙酸）脫保護，但不適用含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的肽類的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護基，F(xiàn)moc基對酸很穩(wěn)定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，F(xiàn)moc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌糜谄瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由于側(cè)鏈功能團所帶來的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo基將側(cè)鏈基團暫時保護起來。保護基的選擇既要保證側(cè)鏈基團不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環(huán)用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護，用冷的三氟乙酸脫去。
固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個相應(yīng)的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。
裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被采用。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。

什么是 α-氨基酸？

α-氨基酸，是羧酸分子中的α碳原子上的氫原子被氨基取代而生成的化合物。一般為無色的結(jié)晶固體，熔點比相應(yīng)的羧酸或胺類都要高，一般在200 ℃ ~300 ℃，有些氨基酸在加熱至熔點溫度時便分解。除了甘氨酸外，其他的α-氨基酸都有旋光性。氨基酸一般易溶于水，難溶于有機溶劑。某些氨基酸具有鮮味，如味精的主要成分就是谷氨酸鈉鹽，也有些氨基酸無味或有苦味。 α-氨基酸的立體結(jié)構(gòu)除甘氨酸外，α-氨基酸的α-碳原子上所連結(jié)的4個基團都不相同。此時4個基團的排列方式從三度空間看，有兩種方式。這兩種方式相互成鏡子中的影子，而不可重疊，互成立體異構(gòu)體，因此α-氨基酸有立體異構(gòu)體存在。兩種異構(gòu)體分別稱L型和D型。除甘

氨基酸保護試劑有哪些

Boc-N-甲基-L-纈氨酸; N-叔丁氧羰基-N-甲基-L-纈氨酸 Boc-N-甲基-O-芐基-L-酪氨酸 BOC-N-ME-TYR-OH Fmoc-N-甲基-L-纈氨酸 N-Fmoc-N-甲基-O-叔丁基-L-蘇氨酸 N-Fmoc-N-甲基-O-叔丁基-L-絲氨酸 Boc-N-甲基-L-苯丙氨酸 Fmoc-N-甲基-L-亮氨酸 Fmoc-N-甲基-L-異亮氨酸 FMOC-N-甲基-L-丙氨酸 BOC-N-甲基-L-丙氨酸 BOC-TRYPTOPHANOL Cbz-L-苯丙氨醇 N-Boc-L-苯丙氨醇 Cbz-L-纈氨酸 N-芐氧羰基-O-叔丁基-L-酪氨酸二環(huán)己胺鹽 N-芐氧羰基-D-色